理科选修《生物安全与人类生活》课件第六章转基因动物生物安全.ppt
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- 生物安全与人类生活 理科 选修 生物 安全 人类 生活 课件 第六 转基因 动物
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1、是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因,且外源基因能稳定地外源基因能稳定地遗传给后代遗传给后代的遗传工程动物。转基因动物研究是人类按自己的意愿地改变动物的遗传组成,在技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。根据不同的目的,转基因动物操作可以简单地划分为四种类型:型转基因动物;利用转基因动物;改良型肉质、长速、代谢等;基础疾病和药物筛选模型等。生产转基因动物的有:原核期胚胎显微注射法、精子载体法、慢病毒载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等。(参见第四章参见第四章),Lin发明了显微注射法,拉开了全球转基因动物研究的序幕。,Jaenisch把猿猴
2、病毒SV40注入小鼠囊胚腔,得到部分体组织中含有SV40 DNA的嵌合体小鼠;并利用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组,创建了世界上第一个转基因小鼠系。,Gordon首先用显微注射的方法将外源mRNA源和DNA注射到非洲爪蟾胚胎,发现被注入的核酸完全有功能。,Gordon等采用显微注射的方法将猿猴病毒和人单纯疱疹病毒的thymidine kinase基因整合后的质粒直接注入小鼠受精卵原核中,产生了世界上第一只转基因小鼠。,Gordon和Ruddle创造了新名词“转基因”transgenic,Palmiter等采用显微注射法将人的生长激素基因注射到小鼠受精卵雄原核中,
3、首次获得整合并表达生长激素外源基因的超级转基因小鼠,生长速度快24倍,体形大1倍。,Simons等把羊的-乳球蛋白基因导入小鼠基因组中,阳性小鼠乳腺中分泌出该蛋白。“家畜乳腺生物反应器”由此而来。,英国罗斯林研究所和PPL公司合作,由科学家Wilmut等获得了世界首例动物转基因绵羊多莉,其细胞中含有1个标记基因和人类凝血因子基因,成为转基因动物研究的一个。,美国科学家宣布培育出世界上首只转基因猴,这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物,为人类最终战胜糖尿病、乳腺癌、帕金森症和艾滋病等带来曙光。,欧洲药监局批准GTC公司生产的ATryn(重组人抗凝血酶)用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症。,这项药物获
4、得了美国食品和药物管理局的批准,这是。目前国外已成功制备了等动物7月5日,世界上第一只克隆羊“”在英国苏格兰卢斯林研究所的试验基地诞生。从1只6岁雌性的芬兰多塞特白面绵羊的乳腺中取出乳腺细胞,放入低浓度的培养液中,细胞逐渐停止分裂,此细胞称为;从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞,并立即将细胞核除去,留下一个无核的卵细胞,称之为;利用电脉冲方法,使供体细胞和受体细胞融合,最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应,使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化,从而形成胚胎细胞。将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内,胚胎细胞进一步分化和发育,最后形成小
5、绵羊多莉。19661966 配子的微注射技术建立(Lin)19771977 mRNA和DNA转移爪蟾卵细胞(Gordon)1980-19811980-1981 转基因小鼠获得成功19811981 小鼠胚胎干细胞转移19821982 转基因“超级鼠”19831983 转基因小鼠组织特异性表达19851985 转基因家畜19871987 嵌合体“敲除”鼠成功19891989 定位整合的种系嵌合体小鼠19941994 精子细胞的移植19971997 绵羊的体细胞克隆19981998 利用核移植技术产生转基因绵羊19991999 “敲除”家畜获得成功,陆德裕等将人-珠蛋白基因注入小鼠受精卵,得到转基因
6、小鼠,开启了中国转基因动物研究的先河。分别获得了含人生长激素(MT-hGH)基因的转基因泥鳅和小鼠,。,获得含有大肠杆菌galK(半乳糖激酶)和gpt(谷丙转氨酶)基因的转基因小鼠。,国家“863”计划将转基因山羊乳腺生物反应器研究列入重大项目,中国农业大学等机构获得动物乳腺生产的IBDV疫苗和干扰素。相继获得含HBsAg基因的转基因兔、转基因猪;含EPO和人HBsAg的乳腺特异性表达的转基因山羊;含人凝血因子IX的转基因山羊(1998);含人血清白蛋白基因的转基因奶牛(1999)。,周江等在基因剔除研究中获得了国内首例Smad2条件基因打靶小鼠。,王晓梅等采用共培养和脂质体介导方法将金黄地鼠
7、附睾内的精子与NFB-luc+质粒共孵育后,与成熟卵母细胞进行体外受精,阳性胚胎获得率平均为10%。,张敬之等在国内首次用慢病毒载体法成功制备GFP转基因小鼠。,吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪2个方面:转基因动物的。以显微注射法为例,一则统计资料表明:小鼠2.6%大鼠4.4%兔1.5%绵羊0.9%猪0.7%牛0.7%转基因动物。据Wau等计算,生产一头祖代转基因猪需花费2.5万美元,生产一头转基因牛需花费50万美元。体细胞克隆等,有些技术会对动物健康产生危害。由于基因,转基因在宿主基因组中的行为难以控制,转基因插入可能导致内源基因破坏或失活,也可能激活原本关闭的基因
8、(癌基因等),导致阳性个体不育、胚胎死亡、四肢畸形等。转基因(尤其是cDNA)得难以检测。而个别转基因的表达水平又太高,的外源基因动物是很的。Wright G等1991年生产的转 h-抗胰蛋白酶的绵羊,其中一只转基因羊产羔后乳汁中h-抗胰蛋白酶的水平高达60 g/L,这是宿主动物难以承受的。转基因动物携带外源基因,释放至环境中可能通过杂交导致“”,使外源基因转到其野生近缘种造成“基因污染”,危及生物多样性安全。有实验显示转鲑鱼GH基因的雄性青鳉有,释放至自然水体可能会造成野生青鳉种群的灭绝。对两个相同生长阶段的转GH基因银大马哈鱼与非转基因鱼在有捕食者存在(放入较大规格的大西洋鲑)时的存活与生
9、长状况进行观察,发现转基因鱼具有与非转基因鱼相似的,在有捕食者存在的环境中转基因鱼的死亡率并没有升高,且仍能维持较快的生长速度,所以如果转基因鱼进入自然环境,其相似的竞争能力和存活率就有可能使其竞争取代野生鱼。转基因动物器官移植可能会增加机会。转基因动物生产的食物有可能使食用者发生。同时转基因动物的研究还将会引发一系列。大部分转基因研究中由于载体承载能力的限制,所构建的基因构件较小,因此整合后的位置效应更明显。细菌人工染色体载体(可承载300kb)和酵母人工染色体载体(可承载1000kb)使大片段基因转移成为可能。如:要增加某一酪蛋白在乳汁中的含量,可导入该酪蛋白基因及与之连锁的酪蛋白基因。牛
10、的4个酪蛋白基因连锁在6好染色体上,达250kb,连锁基因相互调节,使各酪蛋白基因的表达水平达到理想状态 即将表达水平较高的基因与表达较低的基因一同整合进宿主细胞的基因组中。Clark(1992)等将oBLG(绵羊-乳球蛋白)-h1AT cDNA(1:1)及oBLG与oBLG-hFIX cDNA(3:1)注入小鼠原核期胚胎,结果h1-AT与hFIX的表达都得到提高基质附着区可能是结构基因的界域,将染色质分成许多可独立调控的单元。Mcknight(1992)等将鸡溶菌酶基因的基质附着区(A因子)与小鼠WAP基因组成的杂合基因导入小鼠基因组,结果含A因子的杂合基因在整合外源基因的11个鼠系中均获得
11、表达,但表达水平并没有提高。据统计,全球现有以转基因技术为核心的公司超过40家,已成为21世纪生物技术领域的支柱产业。1998年全球动物生物技术产品销售额估计为6.2亿美元。预计到2010年,仅在农业领域销售额将达到110亿美元,其中75亿美元来自转基因动物品种;而利用转基因动物制作生物反应器生产药物和功能蛋白的销售额预计可达500亿美元。基因过量表达基因敲除或敲入病毒或其它病原的DNA插入诱变据统计,截至2003年底,全世界共施行各种器官移植99.8万例次;至2008年,我国器官移植已累计超过10万例次,仅次于美国在,有希望成为的理想来源猪细胞表面的异种抗原与人体不相容,因此首先要解决器官移
12、植过程中产生的。转基因技术可,成为国内外研究热点。1995年,Rosengard等将人的补体抑制因子即衰退加速因子(hDAF)转移至猪胚中,有27头转基因猪的hDAF在其内皮细胞、血管平滑肌和鳞状上皮细胞等细胞中有不同程度地表达,缓和了异种器官移植过程中的超急性排斥反应。猪用作异种器官移植在临床上的,其他一些国家也在进行之中。这为以猪作为供体异种器官的移植展示了广阔的应用前景。即通过精确地引入或失活与人类疾病及病原体相关基因的表达,使转基因动物产生与人类相似的疾病,用于发病机理、药物筛选和基因治疗等方面的研究。例如:通过表达HBV基因建立的转基因小鼠模型,可对不同发育阶段的肝脏基因表达谱和蛋白
13、组学进行研究,还可用于发现早期诊断的功能基因。1996年Gringrich等将Probasin的启动子中一段454bp的序列与SV40序列连接,转入小鼠受精卵,建立了转基因小鼠前列腺癌动物模型。2008年Roger等通过基因敲除方法构建了囊性纤维化双敲的猪疾病模型,能很好模拟人类新生儿囊性纤维化症状,为疾病防控的研究带来了曙光。2009年,Kragh等建立了7头人类老年痴呆症的小型猪疾病模型。现有:癌症、动脉硬化、镰刀状细胞贫血、地中海贫血例、肝炎、淋巴系统病、老年痴呆症、糖尿病和高血压等。,如Mehtali等建立了表达HIV-1-Tat的转基因小鼠模型,用于筛选抗HIV药物。目前已获得的约,
14、其中模型约,基因的动物模型约,具有极大的推广和应用前景。的可能引起插入突变;基因敲除能灭活特定基因,但灭活的基因仍会有转录和翻译过程,而新蛋白的行为无法预测,不可避免地会影响到分析的结果;目前制作的疾病模型几乎都是小鼠,但某些基因的效应在不同物种间存在着一定的差异,。Dickins等(2007)将启动子(TRE)与RNAi基因结合并转入小鼠,然后与含有tTA的转基因小鼠杂交,制备同时含有2套元件的转基因小鼠。当对这些小鼠给予四环素时,可激活tTA系统,进而激活 TRE启动 RNAi;撤除四环素则可以停止 RNAi,实现 RNAi的可逆调控。,如偶蹄目的猪、灵长目的猴等。目前已获成功的动物生物反
15、应器主要有以下几种途径:在中表达活性成分 1992年Swanson等人制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪,为从人以外的动物体获取人血有效成分提供了新途径通过 1994年Kerr等成功获得了能在尿液中表达人类生长激素(GH)的转基因小鼠,GH含量高达0.5 g/L通过 1999年Tamura将原骨胶原蛋白基因转入蚕体内获得成功通过鸡蛋表达功能蛋白 2002年Harvey 等将基因转入母鸡中,年产蛋330个,蛋清中含有约3.5 g外源蛋白;同年美国TranXenoGen公司在转基因鸡蛋中成功表达了可用于治疗的,表达量达1.5ng/mL;2007年,英国Roslin研究所培育出转有治疗皮肤癌的抗体
16、miR24和-1的转基因母鸡,并且可以稳定的将新基因遗传给后代,实现了在输卵管中获得商业化治疗蛋白。通过动物表达外源蛋白目前公认的生产重组蛋白的中国农业大学制备了在乳腺中表达乳铁蛋白和乳清白蛋白的转基因奶牛,表达量可分别达到 3.4 g/L 和 1.5 g/L。GTC和荷兰Pharming等公司研发的人-抗胰蛋白酶、人组织纤溶酶原激活剂、-葡萄糖苷酶等已经进入临床期,37种进入了临床期段,数百种处于研发阶段。目前世界上还有许多公司通过转基因动物乳腺进行的生产。2002年,Kuroiwa等筛选得到表达人源化抗体的奶牛。2006年6月,美国GTC公司利用转基因羊生产的,成为的转基因动物乳腺生物反应
17、器药物。据美国商业评估公司预测,到2015年转基因动物生产的蛋白药物全球销售额将达1000亿美元我国已成功获得能在乳腺中表达多种药用蛋白或营养保健蛋白的转基因牛、绵羊和山羊,总体水平已基本达到发达国家的先进水平。与细菌、细胞等生物工程制药相比,它有明显:转基因动物的乳汁,可以收集且;目的质,已经过动物体内加工和,不必再进行后加工;是的、的“动物药厂”,是全新的生产模式。美国每年要有 ,才够本国血友病人所需的凝血因子,只要 就可代劳。1010亿美元亿美元/年年转基因奶牛(转基因奶牛(0.5-2.5g/L0.5-2.5g/L)GelaGenGelaGen人乳清过氧化酶人乳清过氧化酶提高免疫力等提高
18、免疫力等 3 3亿美元亿美元/年年人分泌性抗体人分泌性抗体尿路感染、蛀牙尿路感染、蛀牙5 5亿美元亿美元/年年转基因奶牛(转基因奶牛(3g/L3g/L)转基因技术在改善家畜上的首个尝试便是转入GH基因以试图提高猪的生长速度和饲喂效率,希望提高家畜的生长速率从而提高产量。从此,转基因技术在农业领域的应用价值开始显现。转基因鲤鱼F1代是由黄河鲤和草鱼生长激素基因组成的转“全鱼”基因鱼,150天可长至1200克,最大可达2000克;两年可达5000克。生长速度比普通鲤鱼快140%以上。吉鲤是由转基因两倍体鲤鱼与转基因四倍体鱼(两套鲤鱼染色体,两套鲫鱼染色体)结合而培育出无生育能力的吉鲤。吉鲤具有草鱼
19、的生长快优点,又具有鲫鱼的味道。由于不能生育,在推广过程中不存在与其它鱼类杂交引起生态危机之忧。将太平洋大鲑鱼的生长激素基因导入大西洋鲑鱼,后制成三倍体不育品种。1985年,我国学者朱作言等首次用人GH构建载体获得了转基因金鱼,F1代转基因鱼类的生长速度为非转基因鱼的2倍。1988年,Brem等首次利用小鼠的金属硫蛋白启动子生产出可用于商业化表达人GH的罗非鱼。经过20年的发展,。纽约时报曾发表评述,肯定中国开创的转基因鱼研究领先美国三年。2001年,中国科学院武汉水生生物研究所在快速生长转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的研究方面取得了规模化养殖的重要进展。我国转基因鱼已进入控制性生产,培育出的三倍
20、体鱼湘云鲫(鲤)具有生长快、肉质好、体形美、抗逆性强、不繁育等特点,已推广到全国23个省、直辖市。中主要有以下三方面:幼儿和相当一部分成年人因肠道中降解乳糖的酶分泌过少,不能有效地将乳糖降解为半乳糖和葡萄糖,从而造成腹胀和腹泻。人乳中不含-乳球蛋白,后者被认为是引起人过敏反应的主要蛋白,还会影响凝乳的形成和干酪的生产。利用基因敲除技术,以人奶中含量高、氨基酸组成平衡的乳白蛋白取代牛奶中的乳球蛋白,牛奶性质会更接近于人奶。:人乳中重要的抗菌蛋白,可以增强婴儿对肠道感染的抵抗力,乳汁成分中溶菌酶含量的提高,可减少奶畜乳房炎的发生,延长奶的保鲜期。能促进婴儿对铁的吸收,提高婴儿免疫力,抵抗消化道疾病
21、的感染。乳铁蛋白在人乳中的含量为12 g/L,在牛奶中的含量仅为0.1 g/L。通过转基因方法使奶牛产出的牛奶中乳铁蛋白的含量达到人乳水平,是牛奶“人乳化”的重要一步。1990年,荷兰Pharming公司宣布培育出了含有人乳铁蛋白的转基因牛,预计每年从乳汁中提炼出来的营养奶粉的销售额高达50亿美元。中国农业大学李宁教授及其团队利用转基因体细胞克隆技术,获得转基因克隆奶牛49头,存活29头。人乳铁蛋白在牛乳中平均表达量达3.43g/L,人溶菌酶在转基因牛乳中含量达1.5g/L以上。导入GH基因可以。2005年澳大利亚将GH 基因转入绵羊,转基因羊的生长速度和羊毛质量较对照组均有显著提高。澳大利亚
22、科学家将源于优质羊毛的A2蛋白的主要成分(半胱氨酸)基因导入绵羊胚胎,繁殖出的转基因羊可使羊毛增产5%,估计全年收入增加3亿美元。Powell等将型毛角蛋白的细丝基因导入绵羊基因组并在皮质中特异表达,转基因羊毛以及羊毛中毛脂含量明显提高。2008年10月,日本研究组培养出可结出荧光绿、红、橙3色的蚕茧的转基因蚕。此外还培养出了具有易于粘合细胞性质的转基因蚕,这一成果有望被应用于人造血管等领域。我国西南大学家蚕基因组研究团队也成功开发出转基因新型有色茧品种。研究证实,的作用,转有GH基因的家畜体脂减少,瘦肉率明显提高,利用GH 基因抑制脂肪生成的特性,可对瘦肉型猪进行定向育种和培育。1998年,
23、Biotechnology News报道,美国农业部研究人员利用胰岛素样生长因子-1基因培育出脂肪减少,瘦肉增加的新猪种。膳食中-6和-3两大系列的量与平衡对体内内环境的稳定和正常生长有重要作用。-6高不饱和脂肪酸自然界中比较丰富,-3 高不饱和脂肪酸来源较少,生产含不饱和脂肪酸的家畜对肉质品质的改良极大。2004年日本近畿大学 Saeki等将菠菜D-12去饱和酶基因转入猪体内培育出6头转基因猪,其体内的不饱和脂肪酸要比一般猪高大约20%。2006年,赖良学等获得10头转线虫fat-1基因(-3去饱和酶基因)的体细胞克隆猪,可将猪体内的-6系饱和脂肪酸转化为-3系不饱和脂肪酸,提高了-3系脂肪
24、酸含量,降低了-6/-3的比例,大大提升了猪肉的营养价值。2008年,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所成功培养出10头转-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪。2010年3月12日生物通报道,世界首例能产生-3多不饱和脂肪酸的转基因克隆牛在内蒙古包头茁壮成长。经检测克隆牛体内-3多不饱和脂肪酸含量比普通牛提升了10倍以上,极具开发价值。利用DNA重组技术直接,或并加以一定的修饰,然后转入易感动物的体细胞,使之在染色体中正确整合,如果转基因在宿主基因组中能够表达,则有希望培育出抗该病的转基因动物新品系。人溶菌酶是乳中天然的抗菌蛋白,然而反刍动物组织特异性缺乏溶菌酶。2006
25、年,Maga等生产的表达人溶菌酶蛋白的转基因羊奶中的溶菌酶水平是人奶的68%,体内和体外实验均证实有抑菌作用,无论是否经过巴氏消毒,这种转基因奶都能抑制仔猪肠内埃希氏菌,调节肠道微生态平衡。阮病毒疾病是细胞内正常的阮病毒蛋白的错误折叠所引起的一类疾病,包括牛海绵状脑病、羊痒症和人克雅氏病。PrP 表达减少能有效阻止感染的发生。2001年,Denning等通过核移植方法生产靶基因敲除羊,共获得4只PrP-/+单敲转基因羊2004年,Kuroiwa等通过基因打靶系统生产阮病毒蛋白PrP 双敲牛,在临床、生理学、组织病理学、免疫学以及生殖检测均表现正常。2006年,Golding等应用体细胞核移植和
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