细菌药敏试验及其耐药表型检测课件.ppt
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- 细菌 试验 及其 耐药 表型 检测 课件
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1、第第4 4章章 细菌药物敏感细菌药物敏感试验及其耐药表型检测试验及其耐药表型检测王辉王辉 北京大学医学部北京大学医学部抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验l测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验(Antimicrobial Susceptibility Test),简称药敏试验(AST)。药敏试验的意义药敏试验的意义l预测抗菌治疗的效果;l指导抗菌药物的临床应用;l发现或提示细菌耐药机制的存在,能帮助临床医生选择合适的药物,避免产生或加重细菌的耐药;l监测细菌耐药性,分析耐药菌的变迁,掌握耐药菌感染的流行病学,以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。药敏试验药敏试
2、验lMIC:在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内,通常是1824小时,能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。l对倍稀释的优点:l操作容易l敏感株的MIC呈正态分布l区分异常(R)与敏感(S)的菌群药敏试验折点的建立药敏试验折点的建立 1.MIC的分布的分布2.药代动力学和药效学药代动力学和药效学 定 MIC的折点3.临床疗效和细菌清除率临床疗效和细菌清除率4.抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点l统计学的线性回归l计算错误率:尽可能减少极重要误差(假敏感率)MIC的分布的分布051015200.0080.0320.1250.52832128512药代动力学和药效学药代动力学和药效学l药代动力学:药物吸
3、收,分布,代谢,排泄l药效学:药物对机体的作用l时间依赖型(TMIC:-内酰胺类,大环内酯类l浓度依赖型(AUC/MIC比率:AGS,FQl这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案MIC与抑菌圈直径的线性关系与抑菌圈直径的线性关系耐药 中介 敏感RISLog2.MICD 1 d2 抑菌圈直径(mm)v抑菌圈直径与抑菌圈直径与MIC的关系的关系MIC(ug/ml)1 12 23 35 52 22 22 22 22 21 11 11 11 12 22 25 58 8111251 12 25 568小误差中介中介3234耐药耐药重要误差小误差9敏感敏感小误差极重要误差小误差2426283014182
4、0220.250.510121248256256163264128不同国家的不同国家的判定折点判定折点可能不同可能不同l原因:l用药剂量不同,服药的间隔不同l评价敏感时较保守l更强调检测出耐药株(即特定的耐药群)l技术因素:接种、培养基在我国主要遵循临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的抗菌药物选择原则。敏感性分类敏感性分类(CLSI的的定义定义)l敏感(Susceptible)l用常规用量治疗有效l常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。l耐药(Resistance)l用常规用量治疗不能
5、抑制细菌的生长lMIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度敏感性分类(敏感性分类(2)l中介(Intermediate)lMIC接近血、体液中药物的浓度,治疗反应率低于敏感株l药物生理浓集部位有效(尿-FQ)l加大用药剂量可能有效l缓冲区:防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误药敏试验的方法学药敏试验的方法学l半定量纸片扩散法 (抑菌圈直径)lMIC法:l稀释法(肉汤、琼脂)l自动化仪法l抗生素连续梯度法(Etest)l流式细胞仪l 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生
6、长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。l 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。纸片扩散法(纸片扩散法(Kirby-Bauer法)法)纸片扩散法纸片扩散法1.水解酪蛋白(MH)培养基,pH7.27.4,做成琼脂厚度4mm,直径90mm的平板;2.挑取孵育16 24小时已分纯菌落,置于生理盐水管中,振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。纸片扩散法纸片扩散法3.用无菌棉拭子蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液;4.然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60度;5.最后沿平板内缘涂抹1周;6.平板在室温下干燥35min,用无菌镊子或商品化的
7、纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心距离应大于24mm,纸片距平板内缘大于15mm。纸片扩散法纸片扩散法7.35孵育1624小时量取抑菌圈直径;8.根据抑菌环的直径,按照CLSI标准判读,报告敏感、中介、耐药。2022-10-3118纸片扩散法影响因素纸片扩散法影响因素lMICl接种菌量l细菌生长率l抗生素含量、扩散性l平皿厚度l温度,预孵育时间2022-10-3119纸片扩散法标准化纸片扩散法标准化lCLSI:美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)l每年修订更改l包括质控l新药的判定标准l特殊耐药性的检测20
8、22-10-3120CLSI的法规的法规l规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控;l规定常规测试报告的抗生素;l不同的药判定标准不同;l不同的菌判定标准也不同。2022-10-3121常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(1)肠杆菌科 绿脓和非肠杆菌科一 级 氨苄西林 头孢他啶,庆大霉素 头孢唑林,庆大霉素替卡西林,哌拉西林二级 阿米卡星 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 头孢吡肟,头孢哌酮 阿莫西林/克拉维酸氨曲南 头孢呋肟,头霉素环丙沙星,亚胺培南 头孢噻肟,头孢曲松 替卡西林/克拉维酸 环丙沙星,亚胺培南 妥布霉素,复方磺胺 替卡西林,哌拉西林 三级 氨曲南,头孢
9、他啶头孢曲松 卡那霉素,奈替米星 氯霉素,奈替米星 妥布霉素 四环素,氯霉素 2022-10-3122常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(2)葡萄球菌肠球菌一级 苯唑西林,青霉素 青霉素,氨苄西林二级 红霉素类万古霉素 克林霉素,万古霉素三级 氯霉素庆大霉素2022-10-3123常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(3)流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级 氨苄西林,青霉素青霉素,红霉素 复方磺胺 复方磺胺二级 头孢呋肟,头孢噻肟氧氟沙星,四环素 头孢他啶,氯霉素 万古霉素三级 阿奇霉素,头孢克罗氯霉素,利福平 环丙沙星,亚胺培南利福平,四环素2022-10-3124预报用药
10、预报用药(一一)测试药菌名推测其他药物的敏感性l 苯唑西林 葡萄球菌所有-内酰胺类l 四环素所有(除葡多西环素,米诺环素 萄球菌和不 动杆菌l红霉素G球菌罗红霉素,克拉霉素,阿奇霉素l克林霉素所有林可霉素2022-10-3125预报用药预报用药(二二)测试药菌名推测其他药物的敏感性l氨苄西林肠球菌青霉素l青霉素G葡萄球菌氨苄西林,美洛西林 替卡西林l头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定,头孢氨苄 头孢克罗l奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类l万古霉素所有替考拉宁l以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释),经培养后观察其最低抑菌浓度。l稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法,
11、用肉汤培养基者为肉汤稀释法。药敏试验药敏试验-稀释法稀释法常用抗菌药物容积稀释法步骤浓度(mg/mL)来源体积(mL)CAMHB(mL)最终浓度(mg/mL)15120储存液195122512步骤1112563512步骤1131284512步骤11764564步骤41132664步骤41316764步骤417888步骤711498步骤7132108步骤7171111步骤10110.5121步骤10130.25131步骤10170.125抗菌药物的稀释和融解抗菌药物的稀释和融解2022-10-3129肉汤稀释法肉汤稀释法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清抗生素倍比
12、稀释,种菌105CFU/ml,孵育35,1620h,判读。2022-10-3130肉汤稀释法肉汤稀释法l调节离子浓度的MH肉汤l宏量肉汤法(2ml,13x100mm)微量肉汤法 (0.1ml,微量板)自动化仪l优点:准确,可靠,可用于研究。l缺点:l劳动强度大l细菌生长情况不可查2022-10-3131琼脂稀释法琼脂稀释法 浓度 16 32 64 128 256 ug/ml 制备含对倍抗生素浓度梯度的平板,制备菌悬液,点种菌,104/每个点,孵育,判读结果2022-10-3132琼脂稀释法琼脂稀释法l优点:金标准 精确可靠l可同时测定多株菌(40株)l细菌生长情况可查l缺点:l测多个药时劳动强
13、度大l制备平皿费时费力E test 法法nE试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体,一面固定有一系列预先制备的,浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物,另一面有读数和判别的刻度;n抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围;n将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上,经孵育过夜,围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈,圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。2022-10-31wanghui-ART34E test 法法 细菌生长区E test 塑料条椭圆形细菌生长抑制区256128 8016判读抑菌浓度(MIC ug/ml)E test 法法l菌液制备及接种均同纸片扩散法。l9
14、0mm平板上可放E试验试条1 2条,140mm平板最多可放6条。l孵育温度及时间同纸片扩散法。2022-10-3136E test 法法l优点l连续浓度梯度,与琼脂稀释法相关性好l影响因素少,稳定性高l操作简单,省时l缺点:昂贵l用途:快生长菌,苛养菌,厌氧菌,酵母菌,分枝杆菌2022-10-3137评价药物体外抗菌活性的指标评价药物体外抗菌活性的指标lMIC50,MIC90,MIC 均值,MIC 范围,R,I,SlMIC50/MIC90:MIC从小到大排列,位于第50/90百分位菌株的MIC值l单纯比较MIC50,MIC90是片面的,还要同时看平均MIC及MIC范围l同时结合R,I,S,(不
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