第二章生物制药工艺技术基础课件.ppt

1、第二章第二章生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础生化制药的六个阶段生化制药的六个阶段 1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理2.细胞的粉碎细胞的粉碎3.提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。艺过程。4.纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。过程。5.浓缩、干燥及保存浓缩、干燥及保存6.制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻

2、干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。第一节第一节生物材料与生物活性物质生物材料与生物活性物质一、一、生物材料的来源生物材料的来源概述：概述：1.动、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物是生产动、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物是生产生物药物的生物资源；生物药物的生物资源；2.动植物细胞培养与微生物发酵技术是获得生物制药原料的动植物细胞培养与微生物发酵技术是获得生物制药原料的重要途径；重要途径；3.基因工程技术、细胞工程技术和酶工程技术是开发生物基因工程技术、细胞工程技术和酶工程技术是开发生物制药资源的新途径。制药资源的新途径。（一）（一）动物脏

3、器动物脏器主要来源是猪、牛、羊和家禽、鱼类等的脏器，包括胰脏、主要来源是猪、牛、羊和家禽、鱼类等的脏器，包括胰脏、脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体和心脏等。脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体和心脏等。1.胰脏胰脏位于胃的后方，横于腹后壁，是动物体内不可替代的位于胃的后方，横于腹后壁，是动物体内不可替代的实质性腺体之一。分泌胰岛素和胰高血糖素，调节糖的代谢；实质性腺体之一。分泌胰岛素和胰高血糖素，调节糖的代谢；还分泌各种消化酶，如胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。已用还分泌各种消化酶，如胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。已用胰脏提取的生物药物有胰脏提取的生物药物有40多种。多种。2.脑脑脑组织富含

4、脂质，脑组织中脂类占脑组织富含脂质，脑组织中脂类占13.5%，蛋白质占，蛋白质占8-10%，脂类物质主要是磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、，脂类物质主要是磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、神经节苷脂和胆固醇，还有神经递质和多种神经肽。神经节苷脂和胆固醇，还有神经递质和多种神经肽。3.胃胃其位置、形态因人而异，一般在左上腹，瘦长型的人其位置、形态因人而异，一般在左上腹，瘦长型的人常为垂直的长胃。为动物的消化器官，主要分泌消化液，如常为垂直的长胃。为动物的消化器官，主要分泌消化液，如胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等。胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等。4.肝脏肝脏位于右上腹部，是机体内最大的实

5、质性腺体，是机位于右上腹部，是机体内最大的实质性腺体，是机体的体的“生化反应器生化反应器”，含有复杂的酶系。已知的肝脏酶达数，含有复杂的酶系。已知的肝脏酶达数百种。用肝脏可制备肝注射液、肝水解物、肝细胞生长因子、百种。用肝脏可制备肝注射液、肝水解物、肝细胞生长因子、造血因子等。造血因子等。5.脾脏脾脏位于胃的左后侧位于胃的左后侧,左侧左侧9-11肋骨内侧的一个长圆形肋骨内侧的一个长圆形暗红色器官暗红色器官,是体内最大的周围淋巴器官、免疫器官，已用是体内最大的周围淋巴器官、免疫器官，已用于生产的药物有脾水解物、脾于生产的药物有脾水解物、脾RNA和脾转移因子。和脾转移因子。6.小肠小肠消化和吸收的

6、主要场所，小肠的长度在成人平均是消化和吸收的主要场所，小肠的长度在成人平均是5-7米，含有米，含有30多种胃肠道激素。多种胃肠道激素。7.脑垂体脑垂体悬垂于脑的底部，体积很小，总重量不到悬垂于脑的底部，体积很小，总重量不到1克，但结克，但结构复杂，包括腺垂体和神经垂体两部分，分泌的激素种类多，构复杂，包括腺垂体和神经垂体两部分，分泌的激素种类多，作用广泛，并能调节其他内分泌腺的活动。作用广泛，并能调节其他内分泌腺的活动。8.心脏心脏位于胸腔内，膈肌的上方，二肺之间，是一个厚壁的位于胸腔内，膈肌的上方，二肺之间，是一个厚壁的肌性有腔器官，具有节律性的收缩能力。心脏含有丰富的糖元、肌性有腔器官，具

7、有节律性的收缩能力。心脏含有丰富的糖元、激素和酶类，用心脏为原料生产的药物主要有细胞色素激素和酶类，用心脏为原料生产的药物主要有细胞色素C、辅辅酶酶Q10和心血通注射液。和心血通注射液。（二）（二）血液、分泌物和其血液、分泌物和其他代谢物他代谢物以血液为原料可生产多种药以血液为原料可生产多种药物，如凝血酶、血红蛋白、物，如凝血酶、血红蛋白、SOD、干扰素等。干扰素等。其他，如尿液、胆汁、蛇毒、其他，如尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料。蜂毒也是重要的生物材料。（三）（三）海洋生物海洋生物海洋生物约占全球生物的一半，估计多达海洋生物约占全球生物的一半，估计多达5亿种，是开发亿种，是开发新药

8、的重要宝库。新药的重要宝库。1.海藻海藻已从藻类生物中发现、提取了一些抗肿瘤、防治心已从藻类生物中发现、提取了一些抗肿瘤、防治心血管疾病、治疗慢性气管炎、驱虫、抗放射线物质等。血管疾病、治疗慢性气管炎、驱虫、抗放射线物质等。2.腔肠动物腔肠动物属于原始多细胞动物，已应用的不多，已提取属于原始多细胞动物，已应用的不多，已提取的有前列腺素类、萜类抗菌物质、抗癌物质。的有前列腺素类、萜类抗菌物质、抗癌物质。3.节肢动物节肢动物其中的某些甲壳动物（包括虾、蟹）可供药用，其中的某些甲壳动物（包括虾、蟹）可供药用，从中提取的甲壳素可用于甲亢、肿瘤、肝炎、肾炎和糖尿从中提取的甲壳素可用于甲亢、肿瘤、肝炎、肾

9、炎和糖尿病等的辅助治疗，另外在食品工业上有重要用途，如用于病等的辅助治疗，另外在食品工业上有重要用途，如用于废水处理、食品添加剂、减肥。废水处理、食品添加剂、减肥。4.软体动物软体动物包括螺、蚌类和乌贼等，已从其中提取出一些包括螺、蚌类和乌贼等，已从其中提取出一些具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、降血脂、止血、平喘作用的具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、降血脂、止血、平喘作用的多糖、多肽、毒素等。多糖、多肽、毒素等。5.棘皮动物棘皮动物包括海星、海胆、海参，关于海胆的研究很多，包括海星、海胆、海参，关于海胆的研究很多，已提取到不少药物，还发现了在化工方面的应用。已提取到不少药物，还发现了在化工方面的应用。6.

10、鱼类鱼类可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。7.爬行动物爬行动物海生爬行动物有海蛇、海龟等，海蛇毒液含海生爬行动物有海蛇、海龟等，海蛇毒液含有多种酶类。有多种酶类。8.海洋哺乳动物海洋哺乳动物从鲸鱼、海豚，可以提取多种药物。从鲸鱼、海豚，可以提取多种药物。（四）（四）植物植物药用植物品种繁多，除含有药用植物品种繁多，除含有生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油、树脂、鞣质等有效药挥发油、树脂、鞣质等有效药理成分外，还含有氨基酸、蛋理成分外，还含有氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素等生化成分。维生素等生

11、化成分。如天花粉蛋白、菠萝蛋白酶、如天花粉蛋白、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。药用植物中的主要药理成分：药用植物中的主要药理成分：1.生物碱，生物碱，是生物体中一类含氮有机化合物的总称，它们有类是生物体中一类含氮有机化合物的总称，它们有类似碱的性质，能和酸结合成盐。如麻黄碱、吗啡。似碱的性质，能和酸结合成盐。如麻黄碱、吗啡。2.强心苷，强心苷，是一类对心肌有兴奋作用，具有强心生理活性的成分，是一类对心肌有兴奋作用，具有强心生理活性的成分，它们的分子中都有一个它们的分子中都有一个C17位被不饱和内酯环所取代的甾体母核。位被不饱和内酯环所取代的甾体母核。如洋地

12、黄毒苷。如洋地黄毒苷。3.黄酮，黄酮，系两个芳环通过三碳链相互连结而成的一系列化合物，系两个芳环通过三碳链相互连结而成的一系列化合物，大多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷。大多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷。银杏中含银杏素、异银杏素、白果素等都是黄酮类，它们具有银杏中含银杏素、异银杏素、白果素等都是黄酮类，它们具有解痉、降压、扩张冠状血管等药理作用。解痉、降压、扩张冠状血管等药理作用。4.皂苷，皂苷，是一类比较复杂的化合物，它们的水溶液振摇时能是一类比较复杂的化合物，它们的水溶液振摇时能产生大量持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似，故名皂苷。它产生大量持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似，故

13、名皂苷。它们有减低液体表面张力的作用，可以乳化油脂，用做去垢们有减低液体表面张力的作用，可以乳化油脂，用做去垢剂。人参中含皂苷总量约剂。人参中含皂苷总量约4%。5.挥发油，挥发油，是具香味和挥发性、可随水蒸气蒸馏的易流动的是具香味和挥发性、可随水蒸气蒸馏的易流动的油状液体。它们多数具有多方面的药理作用，如解表、发油状液体。它们多数具有多方面的药理作用，如解表、发汗、驱风、镇痛、杀虫、抗菌。薄荷、茴香、樟木、桂皮汗、驱风、镇痛、杀虫、抗菌。薄荷、茴香、樟木、桂皮都含有挥发油。都含有挥发油。6.树脂，树脂，常与挥发油、树胶、有机酸等混合存在，与挥发油常与挥发油、树胶、有机酸等混合存在，与挥发油共存

14、的称油树脂，与树胶共存的称胶树脂，与芳香族酸共共存的称油树脂，与树胶共存的称胶树脂，与芳香族酸共存的称香树脂。药用的如松香、乳香、没药、安息香等存的称香树脂。药用的如松香、乳香、没药、安息香等.7.鞣质，鞣质，又称丹宁，鞣酸，是存在于植物中的一类分子较大又称丹宁，鞣酸，是存在于植物中的一类分子较大的复杂多元酚类化合物，可与蛋白质结合成不溶于水的沉的复杂多元酚类化合物，可与蛋白质结合成不溶于水的沉淀，故能与生兽皮结合而形成致密、柔顺、不易腐败又难淀，故能与生兽皮结合而形成致密、柔顺、不易腐败又难以透水的皮革，所以称为鞣质。茶叶、柿子中含有丰富的以透水的皮革，所以称为鞣质。茶叶、柿子中含有丰富的鞣

15、质。鞣质可用于解毒、抗菌、治疗烧伤（使创面收敛、鞣质。鞣质可用于解毒、抗菌、治疗烧伤（使创面收敛、干燥、结痂）。干燥、结痂）。（五）（五）微生物微生物微生物资源非常丰富，其代谢产物有微生物资源非常丰富，其代谢产物有1300多种，已大量生多种，已大量生产的才近产的才近100种，微生物酶有几千种，已被应用的才几十种，种，微生物酶有几千种，已被应用的才几十种，可见其应用前景广阔。可见其应用前景广阔。1.细菌细菌常用细菌发酵法生产乳酸（消毒防腐药，用于空气常用细菌发酵法生产乳酸（消毒防腐药，用于空气消毒）、醋酸、丙酮、丁酸，它们在医药工业应用很广。消毒）、醋酸、丙酮、丁酸，它们在医药工业应用很广。利用

16、细菌生产氨基酸、有机酸、糖类、核苷酸类、维生素、利用细菌生产氨基酸、有机酸、糖类、核苷酸类、维生素、酶，发展潜力很大。酶，发展潜力很大。用埃希氏大肠杆菌生产的天冬酰胺酶是治疗肿瘤的第一个酶用埃希氏大肠杆菌生产的天冬酰胺酶是治疗肿瘤的第一个酶制剂。制剂。2.放线菌放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有的是最重要的抗生素产生菌，已有的1000多种抗多种抗生素产自放线菌；还利用放线菌生产氨基酸、核苷酸类、生素产自放线菌；还利用放线菌生产氨基酸、核苷酸类、维生素、酶。维生素、酶。3.真菌真菌可以利用真菌生产酶、有机酸、氨基酸、核酸、可以利用真菌生产酶、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、促生素、多糖；还可以直接

17、利用真菌本身作为药维生素、促生素、多糖；还可以直接利用真菌本身作为药物，如灵芝、银耳、冬虫夏草。物，如灵芝、银耳、冬虫夏草。4.酵母菌酵母菌可生产维生素、蛋白质、多肽和核酸等。可生产维生素、蛋白质、多肽和核酸等。（六）（六）开发生物新资源开发生物新资源1.动植物细胞的大规模培养动植物细胞的大规模培养2.应用基因工程技术，生产各种生物活性物质，尤其适应用基因工程技术，生产各种生物活性物质，尤其适合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物质的生产。合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物质的生产。二、二、生物活性物质的存在方式生物活性物质的存在方式（一）（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能生物活

18、性物质的存在方式与其生物功能生物活性物质分为生物活性物质分为“胞内胞内”与与“胞外胞外”两种存在部两种存在部位。位。存在于细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，存在于细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。对于胞内物质的提取要先破碎细胞；对于膜上物质对于胞内物质的提取要先破碎细胞；对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。（二）（二）生物分子间的作用力生物分子间的作用力生物分子间主要是通过一些非共价键，如氢键、盐生物分子间主要是通过一些非共价键，如氢键、盐键、金属键、

19、范德华力、疏水键、碱基堆积力所维系，键、金属键、范德华力、疏水键、碱基堆积力所维系，其键能较弱；其键能较弱；生物大分子的空间高级结构也是由非共价键结合的，生物大分子的空间高级结构也是由非共价键结合的，因此分离时应十分小心，确保立体结构不受破坏。因此分离时应十分小心，确保立体结构不受破坏。通常在十分温和条件下操作。通常在十分温和条件下操作。三、生物活性物质的存在特点三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（一）生物材料组成的复杂性不同生物含有不同种类的活性物质。不同生物含有不同种类的活性物质。同种生物，由于细胞的类型、年龄、分化程度的不同同种生物，由于细胞的类型、年龄、分化程度的不同

20、都会改变活性物质的组成。都会改变活性物质的组成。如：胸腺激素只能从幼龄动物中提取；绒毛膜促性腺如：胸腺激素只能从幼龄动物中提取；绒毛膜促性腺激素激素(HCG)只能从孕妇尿中提取。只能从孕妇尿中提取。（二）（二）生物活性物质存在的特点生物活性物质存在的特点1.生物活性物质在生物体材料中含量较低、杂质含量很高。生物活性物质在生物体材料中含量较低、杂质含量很高。例如：胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二，胆汁中的例如：胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二，胆汁中的胆红素含量为万分之五至八。胆红素含量为万分之五至八。2.生物材料中的生化组成数量大，种类多，目的物与杂质生物材料中的生化组成数量大，种类多，目的物

21、与杂质的理化性质接近，分离纯化困难。的理化性质接近，分离纯化困难。四四、生物材料的准备生物材料的准备（一（一)生物材料的选取生物材料的选取选择原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；选择原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化等。中杂质含量少，便于分离纯化等。1.有效成分的含量有效成分的含量(1)生物品种：催乳素以哺乳动物为材料生物品种：催乳素以哺乳动物为材料(2)合适的组织器官合适的组织器官：免疫球蛋白以血液为原料：免疫球蛋白以血液为原料(3)生物的生长期生物的生长期2.杂质情况

22、杂质情况3.来源来源（二）（二）生物材料的采集、预处理与保存生物材料的采集、预处理与保存采集：采集：必须快速、及时速冻、低温保存。必须快速、及时速冻、低温保存。预处理：预处理：1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。离等基本操作。便于贮存和运输。2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。以便抑制微生物和酶的作用。3、有机溶剂除去部分水分：用

23、丙酮或乙醇进行脱水和、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。脱脂，有利于贮存。保存方法：保存方法：有速冻、冻干、或浸存于丙酮与甘油中。有速冻、冻干、或浸存于丙酮与甘油中。第二节 细胞破碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。于提取或吸附。动物脏器组织：动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：植物肉质组织：常用磨碎法；常用磨碎法；微生物：微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨

24、、超声、加压等常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等处理方法。处理方法。1.1.机械法机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.2.物理法物理法 A A、反复冻融法、反复冻融法：把待破碎的样品冷至把待破碎的样品冷至-20-20-15-15 ，使，使 之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物 细胞及细胞内的颗粒可以破碎。细胞及细胞内的颗粒可以破碎。B B、冷热交替法

25、：冷热交替法：将材料投入沸水中，在将材料投入沸水中，在9090左右维持数左右维持数 分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞 被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。C、超声波处理法：、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用时，常用50100mg/L菌体浓度，在菌体浓度，在110KC频率下频率下处理处理1015min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。操作时注

26、意避免溶液中气泡的存在。D、加压破碎法：、加压破碎法：加气压或水压，达加气压或水压，达0.5934.32MPa(210350kgf/cm2)的压力时，的压力时，可使可使90%以上细胞被以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。3.化学法化学法：用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂、表面活性剂处理细胞。用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂、表面活性剂处理细胞。4.生化法生化法：A.自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞

27、内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4，微生物微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。比较少用。4.生化法生化法：A.自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含

28、物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4，微生物微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。比较少用。B.溶菌酶处理法：溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造酶。多用于微生物。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用时，采用pH8.0的的

29、0.1mol/LTris-0.01mol/LEDTA制成制成2亿个亿个/mL的细胞悬液，然后加的细胞悬液，然后加入入100g1mg的溶的溶菌酶，在菌酶，在37oC保温保温10min，细菌胞壁即被破坏。，细菌胞壁即被破坏。一、提取方法1.用酸、碱、盐水溶液提取用于提取各种水溶性、盐溶性的生化物质，这类溶剂提供了用于提取各种水溶性、盐溶性的生化物质，这类溶剂提供了一定的离子强度、一定的离子强度、pH值及相当的缓冲能力。值及相当的缓冲能力。某些与细胞结构结合牢固的生物大分子，在提取时采用高浓某些与细胞结构结合牢固的生物大分子，在提取时采用高浓度盐溶液（如度盐溶液（如4mol/L盐酸胍，盐酸胍，8mo

30、l/L脲或其他变性剂，这种脲或其他变性剂，这种方法称方法称“盐解盐解”）。）。第三节第三节生物活性物质的提取生物活性物质的提取2.用表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，在分布于水表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，在分布于水-油油界面时有分散、乳化和增溶作用。界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、中性与非离子表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、中性与非离子型。型。离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分子的变性；子的变性；非离子型表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统非离子型表面活性剂变性作用小，适

31、合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。无法提取的蛋白质或酶的提取。阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂SDS可以破坏核酸与蛋白质的离子键可以破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。表面活性剂的亲油、亲水性能的强弱，通常以亲水亲油平表面活性剂的亲油、亲水性能的强弱，通常以亲水亲油平衡值（衡值（H.L.B）表示：表示：H.L.B=亲水基的亲水性亲水基的亲水性/亲油基的亲油性亲油基的亲油性生物提取常用的表面活性剂，其生物提取常用的表面活性剂，其H.L.B多在多在10-20之间。之间。经表面活性剂处理后，它的存在

32、对酶蛋白等的进一步纯经表面活性剂处理后，它的存在对酶蛋白等的进一步纯化带来一定困难，如盐析时很难使蛋白质沉淀，因此需先化带来一定困难，如盐析时很难使蛋白质沉淀，因此需先除去。离子型表面活性剂可用离子交换层析法除去；非离除去。离子型表面活性剂可用离子交换层析法除去；非离子型表面活性剂可用亲脂性葡聚糖凝胶层析法除去；其他子型表面活性剂可用亲脂性葡聚糖凝胶层析法除去；其他表面活性剂可用分子筛层析法除去。表面活性剂可用分子筛层析法除去。3.有机溶剂提取（1）固）固-液提取，常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋液提取，常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等的提取。包括单一溶剂分离法、多种溶剂组合白结

33、合酶等的提取。包括单一溶剂分离法、多种溶剂组合分离法。分离法。常用的有机溶剂：极性溶剂，甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。常用的有机溶剂：极性溶剂，甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。非极性溶剂，乙醚、氯仿、苯。非极性溶剂，乙醚、氯仿、苯。选用有机溶剂，一般采用选用有机溶剂，一般采用“相似相溶相似相溶”原则。原则。采用有机溶剂，既能抑制微生物的生长和某些酶的作采用有机溶剂，既能抑制微生物的生长和某些酶的作用，防止目的物降解失活，也能阻止大量无关蛋白质的溶用，防止目的物降解失活，也能阻止大量无关蛋白质的溶出，有利于进一步纯化。出，有利于进一步纯化。（2）液）液-液萃取液萃取概念：概念：利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶

34、解度的差异，将利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响因素：影响因素：目的物在两相的分配比（分配系数目的物在两相的分配比（分配系数K）；）；有机溶剂的用量。有机溶剂的用量。K增大，提取效率增大。增大，提取效率增大。K值较小时，可以适当增加有机溶剂的用量，采用多次值较小时，可以适当增加有机溶剂的用量，采用多次提取。提取。溶剂萃取的注意事项：1.pH值值，酸性物质在酸性条件下萃取；，酸性物质在酸性条件下萃取；碱性物质在碱性条件下萃取；碱性物质在碱性条件下萃取；氨基酸等两性电解质，则采用在等电点进行提取。氨

35、基酸等两性电解质，则采用在等电点进行提取。2.盐析盐析，在提取液中加入适量中性盐，促使生化物质转入有，在提取液中加入适量中性盐，促使生化物质转入有机相，从而提高萃取率。并且，盐析作用能减少有机溶剂在机相，从而提高萃取率。并且，盐析作用能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。3.温度温度，室温或低温下操作。因为温度升高，既使生物材料，室温或低温下操作。因为温度升高，既使生物材料不稳定，又易使有机溶剂挥发。不稳定，又易使有机溶剂挥发。4.乳化乳化，乳化层出现使有机相与水相分层困难。，乳化层出现使有机相与水相分层困难。消除乳化的方法包括过滤、离

36、心、轻轻搅动、改变两相的比消除乳化的方法包括过滤、离心、轻轻搅动、改变两相的比例、加热、加电解质（例、加热、加电解质（NaCl,NaOH,HCl）、）、加吸附剂加吸附剂（CaCO3）。液液-液萃取时，溶剂的选择：液萃取时，溶剂的选择：l 具有较高选择性，即具有较高选择性，即K值较大。值较大。l 在萃取后，溶质与溶剂容易分离与回收。在萃取后，溶质与溶剂容易分离与回收。l 两种溶剂的密度相差较大，以减少乳化作用。两种溶剂的密度相差较大，以减少乳化作用。l 无毒，不易燃烧，价廉。无毒，不易燃烧，价廉。超临界萃取超临界萃取优点：节能，可使用生理惰性溶剂在低温下分离组分，有利节能，可使用生理惰性溶剂在低

37、温下分离组分，有利于生物材料活性的保持，于生物材料活性的保持，原理：在某一温度和压力时，气体和液体的物理特性趋于相在某一温度和压力时，气体和液体的物理特性趋于相同，两相变为一相，此时就称为临界点。物质的临界点常数同，两相变为一相，此时就称为临界点。物质的临界点常数包括：临界温度、临界压力和临界密度。对于包括：临界温度、临界压力和临界密度。对于CO2而言，分而言，分别为别为31.1、7.3Mpa和和0.47g/mL。当温度和压力高于上述值当温度和压力高于上述值时，物质处于液体和气体的中间状态，在这种状态下的流体时，物质处于液体和气体的中间状态，在这种状态下的流体称为超临界流体。超临界流体最常用的

38、萃取剂是称为超临界流体。超临界流体最常用的萃取剂是CO2。超临界流体的特性：它们的物理特性和传质特性介于液体它们的物理特性和传质特性介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超临界流体具有与液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超临界流体具有与液体同样的凝集力，溶解力。超临界流体的密度比气体大得多，同样的凝集力，溶解力。超临界流体的密度比气体大得多，与液体较为接近，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速与液体较为接近，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。随着温度和压力的连续变化，超临界流体对物质的萃度。随着温度和压力的连续变化，超临界流体对物质的萃取具有选择性。萃取后易分离，其扩散系数接近于气体，取具有

39、选择性。萃取后易分离，其扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍。超临界流体的粘度大大低于液体的是通常液体的近百倍。超临界流体的粘度大大低于液体的粘度，有利于物质的扩散，节能效果明显。粘度，有利于物质的扩散，节能效果明显。超临界流体的萃取过程：分为萃取阶段和分离阶段。分为萃取阶段和分离阶段。二、提取效率 任何提取的提取效率都不可能达到任何提取的提取效率都不可能达到100%，无论采用什么，无论采用什么提取方法，在生物材料中总要残留部分目的物，残留量的提取方法，在生物材料中总要残留部分目的物，残留量的多少取决于所选择的溶剂系统的种类、用量、提取次数及多少取决于所选择的溶剂系统的种类、用量、提取次数及

40、操作条件，它们的数量关系可以操作条件，它们的数量关系可以“残留量公式残留量公式”表示如下：表示如下：式中，式中，X0为目的物总量为目的物总量,g；K为目的物在固相为目的物在固相/液相的分配系数；液相的分配系数；L为溶剂体积为溶剂体积,ml；W为生物材料重量为生物材料重量,g；n为提取次数。为提取次数。n0nLKWKWXX由上式可见：由上式可见：1.对于所选的溶剂系统而言，目的物在材料中的分配系数对于所选的溶剂系统而言，目的物在材料中的分配系数愈大，提取后的残留物质就愈多。愈大，提取后的残留物质就愈多。2.所用的溶剂愈多，残留量愈少。所用的溶剂愈多，残留量愈少。3.提取次数愈多，残留量愈少。提取

41、次数愈多，残留量愈少。实际工作中，溶剂的用量与提取次数有一定的限制，一实际工作中，溶剂的用量与提取次数有一定的限制，一般生产上多用般生产上多用2-3次提取，溶剂用量为生物材料的次提取，溶剂用量为生物材料的2-5倍。倍。三、影响提取效率的因素1.温度温度大多数不耐热的生物活性物质一般在大多数不耐热的生物活性物质一般在0-10进行提取。某些较耐热的生化成分，如多糖进行提取。某些较耐热的生化成分，如多糖类，可于类，可于5090加热提取。加热提取。2.酸碱度酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定，所多数生化物质在中性条件下较稳定，所以提取用的溶剂系统一般以提取用的溶剂系统一般pH值控制在值控制在4-9范

42、围内，范围内，并且注意避免在目的物的等电点附近进行提取。并且注意避免在目的物的等电点附近进行提取。3.盐浓度盐浓度盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。盐溶：一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，盐溶：一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，此

43、现象称为此现象称为“盐溶盐溶”作用。作用。常用的稀盐提取液：常用的稀盐提取液：NaCl溶液溶液(0.1-0.15mol/L)；磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.02-0.05mol/L)；焦磷酸钠缓冲液（焦磷酸钠缓冲液（0.02-0.05mol/L)；醋酸盐缓冲液（醋酸盐缓冲液（0.10-0.15mol/L)；柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（0.02-0.05mol/L)。四、提取方法的选择关键：关键：针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。提取条件。重点重点了解目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的了解目的物与主要杂质在溶解度方面

44、的差异以及它们的稳定性。稳定性。在提取过程中，尽量增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质在提取过程中，尽量增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度，同时重视生物材料及目的物在提取过程中的活性的溶出度，同时重视生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。变化。活性物质的保护措施1.采用缓冲系统采用缓冲系统2.添加保护剂添加保护剂防止活性基团受破坏防止活性基团受破坏3.抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用4.其他保护措施其他保护措施避免紫外光、强烈搅拌、过酸、过碱或避免紫外光、强烈搅拌、过酸、过碱或高温高温第四节第四节生化物质的分离纯化方法生化物质的分离纯化方法一、一、生物制药中分离、制备方法的特点生物制药

45、中分离、制备方法的特点1.生物材料组成复杂生物材料组成复杂无固定操作方法可循；无固定操作方法可循；2.含量极微含量极微分离操作步骤多，不易获得高收率；分离操作步骤多，不易获得高收率；3.活性成分离开生物体后，易变性，破坏活性成分离开生物体后，易变性，破坏分离进程必分离进程必须十分小心；须十分小心；4.分离几乎都在溶液中进行分离几乎都在溶液中进行按经验进行，严格控制；按经验进行，严格控制；5.分离多采用温和的分离多采用温和的“多阶式多阶式”方式进行，即方式进行，即“逐级分离逐级分离”。操作时间长，手续繁琐。操作时间长，手续繁琐。6.生物产品最后均一性的评估，要采用多种方法。生物产品最后均一性的评

46、估，要采用多种方法。二、二、生物制药中分离制备方法的基本原理生物制药中分离制备方法的基本原理1.根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心、超离根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心、超离心、膜分离、超滤、凝胶过滤；心、膜分离、超滤、凝胶过滤；2.根据分子电离性质（带电性）的差异，如离子交换、电根据分子电离性质（带电性）的差异，如离子交换、电泳、等电聚焦；泳、等电聚焦；3.根据分子极性大小及溶解度不同，如溶剂提取法、逆流根据分子极性大小及溶解度不同，如溶剂提取法、逆流分配、分配层析、盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级沉淀；分配、分配层析、盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级沉淀；4.根据物质吸附性质

47、的不同，如选择性吸附与吸附层析；根据物质吸附性质的不同，如选择性吸附与吸附层析；5.根据配体特异性，如亲和层析。根据配体特异性，如亲和层析。三、三、生物制药中常用的分离纯化方法生物制药中常用的分离纯化方法1.盐析法；盐析法；2.有机溶剂沉淀法；有机溶剂沉淀法；3.等电点沉淀法；等电点沉淀法；4.膜分离法；膜分离法；5.离子交换层析；离子交换层析；6.凝胶层析；凝胶层析；7.亲和层析。亲和层析。1 1、盐析法、盐析法 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下

48、，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。析作用。优点优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。缺点缺点：分级分离能力不高。分级分离能力不高。常用的中性盐常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。盐析时应注意的几个问题：盐析时应

49、注意的几个问题：（1 1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2 2）pH pH 值的选择：蛋白质在值的选择：蛋白质在pIpI时的溶解度最小。因此，时的溶解度最小。因此，进行盐析时的进行盐析时的pHpH，要选择在被分离蛋白质的，要选择在被分离蛋白质的pIpI附近。附近。（3 3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他沉淀，使用盐的饱和度极限也

50、愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。浓度，可避免共沉的干扰。（4 4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。常在常在0-4 0-4 范围内迅速操作。范围内迅速操作。如尿激酶。如尿激酶。（5 5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较才能获得纯品。最常用的脱盐方法