生物化学第一章蛋白质课件.ppt

1、蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。v一：蛋白质概述v二：氨基酸v三：肽与肽键v四：蛋白质的分子结构v五：蛋白质的分子结构与功能关系v六：蛋白质的重要性质v七：蛋白质的分类1.1.蛋白质？蛋白质？蛋白质：蛋白质：Pr(Protein)Pr(Protein)是以氨基酸为组成单位的经肽键连接是以氨基酸为组成单位的经肽键连接 而成的结构复杂的生物高分子。而成的结构复杂的生物高分子。Protein：A word coined by Jons J.Berzelius in 1838 to emphasize t

2、he importance of this class molecules.Derived from the Greek word proteios,which means“of the first rank.”一、蛋白质概述一、蛋白质概述 “生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断地自我更新”。恩格斯反杜林论(18781878年年)蛋白体蛋白体核酸核酸PrPr （结合蛋白质（结合蛋白质:核蛋白）核蛋白）2.2.蛋白体？蛋白体？含量多：含量多：湿重：约占体重的湿重：约占体重的171722%22%；干重：约占细胞干重：约占细胞干重干重45%45%3.3.为什

3、么说：蛋白质是生命的物质基础？为什么说：蛋白质是生命的物质基础？种类多：种类多：一个大肠杆菌：一个大肠杆菌：30003000种种 一个真核细胞：数千种一个真核细胞：数千种 人体内蛋白质：人体内蛋白质：1010万种万种 生物界：约生物界：约1 1百亿种百亿种主要表现在：主要表现在：参与构成各种细胞及组织参与构成各种细胞及组织 参与体内的物质代谢、细胞信号的转导参与体内的物质代谢、细胞信号的转导 及生理功能的及生理功能的调节控制调节控制 特殊功能特殊功能:催化、催化、运输运输、储存、凝血与、储存、凝血与 纤溶、识别、免疫等等纤溶、识别、免疫等等 氧化供能氧化供能:17.15kJ/g17.15kJ/

4、g蛋白质蛋白质功能多：功能多：参与物质代谢调控参与物质代谢调控：蛋白激酶A,蛋白激酶C,磷酸化酶a,钙调蛋白,G蛋白,腺苷酸环化酶等。参与生理功能调控参与生理功能调控：多种生长因子，如表皮生长因子等蛋白质类激素，如胰岛素等。参与基因调控：参与基因调控：组蛋白、非组蛋白、阻遏蛋白、基因激活蛋白等。调控功能：调控功能：二二.蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成元素组成元素组成：1、主要元素：、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。质还含有少量磷和金属元素。碳碳 50 氢氢 7 氧氧 23 氮氮 16%硫硫 04 其他其他 微微 量量(磷、铁、碘、锌

5、和铜磷、铁、碘、锌和铜)l2、特点：、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为平均含氮量为16%。l3、定氮法测定蛋白质含量：、定氮法测定蛋白质含量：l 蛋白质含量蛋白质含量6.25样品含氮量样品含氮量 应用应用：微量凯氏定氮法：微量凯氏定氮法 凯氏定氮法凯氏定氮法l实验原理：蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋

6、夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。(一一)、氨基酸的通式氨基酸的通式(二二)、二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构及三字符号及三字符号(三三)、氨基酸的性质氨基酸的性质蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解解.完全水解得到各种氨基酸的混合物，部完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片

7、段。最后得到各分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。种氨基酸的混合物。所以，所以，氨基酸氨基酸是蛋白质的是蛋白质的基本结构单元基本结构单元。大多数的蛋白质都是由大多数的蛋白质都是由2020种氨基酸组成。种氨基酸组成。这这2020种氨基酸被称为种氨基酸被称为基本氨基酸。基本氨基酸。1.1.氨基和羧基的位置氨基和羧基的位置:分为分为-、-氨基酸等氨基酸等.2.2.连接在手性碳原子上各原子或基团在空间分布连接在手性碳原子上各原子或基团在空间分布 分为分为L-L-氨基酸或氨基酸或D-D-氨基酸氨基酸.3.3.氨基的不同氨基的不同,分为氨基酸和亚氨基酸分为氨基酸和亚氨基酸 4.4.是否有密

8、码：编码和非编码氨基酸是否有密码：编码和非编码氨基酸分类与分类与依据：依据：(一一)、氨基酸的结构、氨基酸的结构氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：与羧基相邻的与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸氨基酸 COOHH2N CH -碳原子基团 R R基团-氨基酸基本结构通式l除甘氨酸外，氨基酸除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性均含有一个手性-碳碳原子，因此都具有旋原子，因此都具有旋光性光性。比旋光度是氨比旋光度是氨基酸的重要物理常数基酸的重要物理常

9、数之一，是鉴别各种氨之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据基酸的重要依据 手性碳原子手性碳原子：连接四个不同的原子或基团。：连接四个不同的原子或基团。手性分子手性分子：与自身镜像不能重叠的分子。：与自身镜像不能重叠的分子。旋光度旋光度：偏振光旋转的角度：偏振光旋转的角度。比旋光度比旋光度：lBt B lt：旋光度：旋光度：质量浓度：质量浓度(g/ml)(g/ml)：测定时的温度：测定时的温度：光源的波长：光源的波长：盛液管的长度（：盛液管的长度（dmdm）构型和命名法构型和命名法D,L-D,L-构型表示法：构型表示法：羟基在碳链右边的为羟基在碳链右边的为 D D 型，它的对映体为型，它的对映体为 L

10、 L 型。型。OHCH2OHCHOHHOCH2OHCHOHD-D-甘油醛甘油醛 L-L-甘油醛甘油醛凡可以从凡可以从D-甘油醛通过化学反应而得到的化合物，或可甘油醛通过化学反应而得到的化合物，或可以转变成以转变成D-甘油醛的化合物，甘油醛的化合物，都具有与都具有与D-甘油醛相同的构型，即甘油醛相同的构型，即D型。与型。与L-甘油醛的甘油醛的相同构型的化合物则是相同构型的化合物则是L型。型。l除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通结构通式式。各种氨基酸的区别在于侧链各种氨基酸的区别在于侧链R R基的不同。基的不同。COOHCHH2NR-氨基酸氨基酸可变部可变部

11、分分不变部不变部分分 甘氨酸甘氨酸 Glycine （1）中性氨基酸）中性氨基酸H2NCH CHOHO1、脂肪族氨基酸、脂肪族氨基酸 （1）中性氨基酸）中性氨基酸H2NCH CCH3OHO甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine（1）中性氨基酸）中性氨基酸H2NCH CCHOHOCH3CH3 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine（1）中性氨基酸）中性氨基酸H2NCH CCH2OHOCH CH3CH3 甘氨酸甘氨酸 G

12、lycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine（1）中性氨基酸）中性氨基酸H2NCH CCHOHOCH3CH2CH3 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine甲硫氨酸甲硫氨酸 Methionine（2）含硫氨基酸）含硫氨基酸H2NCHCCH2OHOCH2SCH3 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine

13、甲硫氨酸甲硫氨酸 Methionine半胱氨酸半胱氨酸 Cysteine （2）含硫氨基酸）含硫氨基酸H2NCH CCH2OHOSH 丝氨酸丝氨酸 Serine （3）含羟基氨基酸含羟基氨基酸H2NCH CCH2OHOOH 丝氨酸丝氨酸 Serine 苏氨酸苏氨酸 Threonine（3）含羟基氨基酸）含羟基氨基酸H2NCH CCHOHOOHCH3 （4）碱性氨基酸）碱性氨基酸精氨酸精氨酸 ArginineH2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH （4）碱性氨基酸）碱性氨基酸精氨酸精氨酸 Arginine赖氨酸赖氨酸 LysineH2NCH CCH2OHOCH2CH2CH2NH2

14、天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate 酸性氨基酸酸性氨基酸H2NCH CCH2OHOCOHO（5）酸性氨基酸及其酰胺）酸性氨基酸及其酰胺 天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸谷氨酸 GlutamateH2NCH CCH2OHOCH2COHO酸性氨基酸酸性氨基酸（5）酸性氨基酸及其酰胺）酸性氨基酸及其酰胺 天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸H2NCH CCH2OHOCNH2O（5）酸性氨基酸及其酰胺）酸性氨基酸及其酰胺 天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺谷氨酰胺 Glutamine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸H2NCHCCH2OHOCH2CNH2O

15、（5）酸性氨基酸及其酰胺）酸性氨基酸及其酰胺 2、芳香族氨基酸、芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸PhenylalanineH2NCHCCH2OHO 芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸酪氨酸TyrosineH2NCHCCH2OHOOH 芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸酪氨酸Tyrosine色氨酸色氨酸 TrytophanH2NCHCCH2OHOHN 碱性氨基酸碱性氨基酸组氨酸组氨酸 HistidineH2NCH CCH2OHONNH3、杂环氨基酸、杂环氨基酸 脯氨酸脯氨酸 Proline（-吡咯烷基吡咯烷基-羧酸）羧酸）亚

16、氨基酸亚氨基酸HNCOHO组氨酸组氨酸 Histidine3、杂环氨基酸、杂环氨基酸 芳香族氨基酸芳香族氨基酸组氨酸组氨酸 Histidine脯氨酸脯氨酸 Proline色氨酸色氨酸 TrytophanH2NCHCCH2OHOHN3、杂环氨基酸、杂环氨基酸甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）亮氨酸亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）含羟基或硫脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨

17、酸谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）杂环杂环苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trp,W）组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）20种氨基酸的名称及缩写代号l在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。为不常见蛋白质氨基酸。l这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。l其中重要的有其中重

18、要的有4-4-羟基脯氨酸、羟基脯氨酸、5-5-羟基赖氨酸、羟基赖氨酸、N-N-甲基甲基赖氨酸、和赖氨酸、和3,5-3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。基酸的结构如下。NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基赖氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 据营养据营养学分类学分类 必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A A（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）

19、芳香族芳香族A(PheA(Phe、TyrTyr，Trp)Trp)杂环杂环(His(His、Pro Pro、Trp)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（9种）种）不带电荷（不带电荷（6种）种）带电荷：正电荷（种）负电荷（种）带电荷：正电荷（种）负电荷（种）据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基一氨基二羧基一氨基二羧基(Glu(Glu、Asp)Asp)二氨基一羧基二氨基一羧基(Lys(Lys、HisHis、Arg)Arg)人的必需氨基酸人的必需氨基酸LysLysTrpTrpPhePheValValMetMetLeuLeuIleIle

20、ThrThrArgArg、HisHisn蛋白质基本结构单位：蛋白质基本结构单位：L 氨基酸氨基酸n 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外n L氨基酸：甘氨酸（无不对称氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外）除外n 氨基酸结构通式：氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOHn 常见氨基酸种类：常见氨基酸种类：20种。种。小结2、氨基酸分类：、氨基酸分类：按其侧链按其侧链的结构和理化性质分类的结构和理化性质分类非极性、疏水氨基酸非极性、疏水氨基酸(非极性非极性R基氨基酸基氨基酸)：Ala,Val,Leu,Ile（支链）；（支链）；Gly（无旋光异构）；（无旋光异构）；Met（含硫）

21、；（含硫）；Phe,Trp（芳香族）；（芳香族）；Pro（亚氨基）（亚氨基）极性氨基酸极性氨基酸(不带电荷的极性不带电荷的极性R基氨基酸基氨基酸)：Ser,Thr（含羟基）；（含羟基）；Tyr（芳香族）；（芳香族）；Cys（含巯（含巯基）；基）；Gln,Asn（含酰胺）（含酰胺）酸性氨基酸（含有两个羧基）：酸性氨基酸（含有两个羧基）：Glu（含（含羧基）、羧基）、Asp（含（含羧基）羧基）碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：Arg（胍基）、（胍基）、His（咪唑基）、（咪唑基）、Lys（氨基）氨基）n含硫氨基酸：含硫氨基酸：Met、Cysn芳香族氨基酸：芳香族氨基酸

22、：Phe、Tyr、Trp据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A A（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族芳香族A(PheA(Phe、TyrTyr，Trp)Trp)杂环杂环(His(His、Pro Pro、Trp)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（9种）种）不带电荷（不带电荷（6种）种）带电荷：正电荷（种）负电荷（种）带电荷：正电荷（种）负电荷（种）1 1一般物理性质一般物理性质2 2两性解离和两性解离和等电点等电点 3 3重要化学反应重要化学反应 与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB

23、)(DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）:用用于蛋白质于蛋白质N-N-端测定端测定.与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITCPITC）的反应）的反应（EdmanEdman反应）：反应）：用用于蛋白于蛋白N-N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。与茚三酮反应与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定 与与甲醛反应甲醛反应：测定蛋白质的水解速度测定蛋白质的水解速度1.一般物理性质一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异(1)溶解性：溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但

24、不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4)旋光性：旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(pI .带负电带负电 pHpI .不带电不带电 pHpI .带负电带负电 pHpI .不带电不带电 pHpI .带正电带正电 n等电点计算等电点计算侧链不含离解基

25、团的中性氨基酸，其等电点是它侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的的pK1和和pK2的算术平均值的算术平均值：pI=(pK1+pK2)同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值值也决定于两性离子两边的也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。值的算术平均值。酸性氨基酸酸性氨基酸(Glu、Asp)及及Cys：pI=(pK1+pK2)碱性氨基酸碱性氨基酸(赖、精、组赖、精、组)：pI=(pK2+pK3)重要化学反应重要化学反应 与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）:用用于

26、蛋白质于蛋白质N-N-端测定端测定.与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITCPITC）的反应）的反应（EdmanEdman反应）：反应）：用用于蛋白于蛋白N-N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。与茚三酮反应与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定 与与甲醛反应甲醛反应：测定蛋白质的水解速度测定蛋白质的水解速度l蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。链以特殊方式结合而成的生物大分子。l蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在

27、将分子量在60006000道尔顿以上的多肽称为道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质。l蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大,从大约从大约60006000到到10000001000000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。l示例示例虾红素虾红素木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶组织蛋白酶组织蛋白酶一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequaternary struc

28、turequaternary structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary structuresupersecondary structureStructure domainStructure domainl蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包包括组成蛋白质的多肽链括组成蛋白质的多肽链数目数目.l多肽链的氨基酸顺序，多肽链的氨基酸顺序，l以及多肽链内或链间二以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。硫键的数目和位置。l其中其中最重要的是多肽链最重要的是多肽链的氨基酸顺序的氨基酸顺序，它是蛋，它是蛋白质生物功能的基础。白质生物功

29、能的基础。n一级结构体现生物信息：一级结构体现生物信息：20n .多样多样n一级结构是空间结构及生物活性的基础一级结构是空间结构及生物活性的基础.特异特异n一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键l在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序列顺序称为氨基酸顺序l通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨氨基，称为氨

30、基端或基端或N-N-端；端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端。端。l氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨端氨基酸残基为终点基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：l Ser-Val-Tyr-Asp-Glnl肽键、肽肽键、肽l氨基酸残基氨基酸残基l蛋白质一级结构蛋白质一级结构l一级结构的连接键一级结构的连接键l蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有了胰岛素

31、的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。上千种不同蛋白质的一级结构被测定。基本战略基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法：片段重叠法氨基酸顺序直测法 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质l(1)，多肽链的拆分，测定多肽链数目多肽链的拆分，测定多肽链数目。l由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。l多肽链的拆分。l几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚称

32、为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿尿素或素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽盐酸胍处理，即可分开多肽链链(亚基亚基).).l测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目。l通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。l(2)，二硫键的断裂l几条多肽链通过二硫键交联在一起。可几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下

33、，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。的巯基，以防止它重新被氧化。胰岛素胰岛素 -巯基乙醇巯基乙醇碘乙酸碘乙酸l(3)(3)测定测定每条多肽每条多肽链的氨基链的氨基酸组成，酸组成，并计算出并计算出氨基酸成氨基酸成分的分子分的分子比；比；l(4)(4)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端l多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-

34、C-端氨基酸。端氨基酸。l在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。N端端 Sanger法（二硝基氟苯反应）法（二硝基氟苯反应）DNS法法（丹磺酰氯反应）（丹磺酰氯反应）Edman法（异硫氰酸苯脂反应）法（异硫氰酸苯脂反应）氨肽酶法氨肽酶法 C端端 肼解法肼解法 还原法还原法 羧肽酶法羧肽酶法lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。l在酸性条件下水解

35、，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸l在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。l此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强

36、的荧光性质，检测灵敏度氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到可以达到1 1 1010-9-9molmol。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸l氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。l羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是

37、一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。l目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。l羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgAr

38、g和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。l(5)(5)多肽链断裂成多个肽段，可采用两多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。分离开来。酶解法酶解法：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶化学法：如溴化氰法化学法：如溴化氰法 羟胺法羟胺法（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe.Trp）

39、l(6)(6)测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。lEdmanEdman（异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上（异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种也是一种N-N-端分析法。此法的特点是能够不断重复端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。端氨基酸残基逐一进行标记和解离。(7)(7)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。的氨基酸顺序。所得资料所得资料：氨基末端

40、残基氨基末端残基 H 羧基末端残基羧基末端残基 S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS第一套肽段第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS(8)(8)确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置蛋白质测序的一般步骤 l（1）拆分蛋白质分子中的多肽链，）拆分蛋白质分子中的多肽链，测定多肽链数目。测定多肽链数目。（

41、2）测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。（3）断裂链内二硫键。断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的分析多肽链的N末端和末端和C末端。末端。（5）多肽链部分裂解成肽段。多肽链部分裂解成肽段。（6）测定各个肽段的氨基酸顺序测定各个肽段的氨基酸顺序（7）确定肽段在多肽链中的顺序。确定肽段在多肽链中的顺序。（8）确定多肽链中二硫键的位置。确定多肽链中二硫键的位置。蛋白质（蛋白质（纯纯）测定分子量，估计测定分子量，估计AA残基数（除残基数（除120）氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪测定测定AA数量、种类和比例数量、种类和比例肽链拆开肽链拆开次级键：用次级键：用8mol/L脲脲 或或6mol/L

42、 盐酸胍盐酸胍二硫键：过甲酸；巯基乙醇；二硫键：过甲酸；巯基乙醇；1，4二硫代苏糖醇二硫代苏糖醇肽链末端分析肽链末端分析N端：端：二硝基氟苯二硝基氟苯;丹磺酰氯法丹磺酰氯法C端：端：肼解法肼解法；羧肽酶法；羧肽酶法肽链选择性裂解肽链选择性裂解化学法：化学法：溴化氰裂解溴化氰裂解；羟胺法；羟胺法酶解法：胃蛋白酶、酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋、糜蛋 白酶、木瓜蛋白酶等白酶、木瓜蛋白酶等肽段分离肽段分离凝胶过滤凝胶过滤离子交换层析离子交换层析氨基酸顺序分析：氨基酸顺序分析：Edman法法（异硫氰酸苯降解法异硫氰酸苯降解法）；酶解法）；酶解法多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸序序列列分分析析的的

43、主主要要步步骤骤（二）蛋白质的空间结构l蛋白质的构象蛋白质的构象（conformation）：指蛋白质分子中所有原子的三维空间排列分布和肽链的走向。l肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。l组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。l肽键中的肽键中的C-NC-N键具有部分键具有部分双键性质，不能自由旋双键性质，不能自由旋转。转。l在大多数情况下，以反在大多数情况下，以反式结构存在。式结构存在。二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为为定点而旋转，绕定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称键旋转的角度称角角，绕，绕C-C键旋转的角度

44、称键旋转的角度称角。角。和和称作称作二面角，亦称构象角。二面角，亦称构象角。-碳原子碳原子酰胺平面酰胺平面=1800，=1800=00，=00的多肽主链构象的多肽主链构象酰胺平面酰胺平面=00，=00侧链侧链非键合原子非键合原子接触半径接触半径l蛋白质的二级蛋白质的二级(Secondary)(Secondary)结结构构是指肽链主链的折叠及盘绕是指肽链主链的折叠及盘绕方式。它只涉及肽链主链的构方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。象及链内或链间形成的氢键。l主要有主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转转角。角。l在在-螺旋中肽平面的键长和键角一定；螺旋中肽平面的键长和键角一定；l

45、肽键的原子排列呈反式构型；肽键的原子排列呈反式构型；l相邻的肽平面构成两面角；相邻的肽平面构成两面角；CONCN+O-CNCOHC l主链骨架围绕中心轴盘绕主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；形成右手螺旋；l螺旋每上升一圈是螺旋每上升一圈是3.6个氨个氨基酸残基，螺距为基酸残基，螺距为0.54nm,两个氨基酸之间的距离为两个氨基酸之间的距离为0.15nm;0.15nm;l 相邻螺旋圈之间形成链内相邻螺旋圈之间形成链内氢键氢键,氢键的取向几乎与轴平氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的行，第一个氨基酸残基的-NH NH 基与前面第四个氨基酸基与前面第四个氨基酸残基的残基的-CO-CO基形成氢

46、键。基形成氢键。l氨基酸残基侧链伸向外侧。氨基酸残基侧链伸向外侧。l影响-螺旋形成的因素主要是：l 存在侧链基团较大的氨基酸残基；l 连续存在带相同电荷的氨基酸残基；l 存在脯氨酸残基。l其结构特征为：其结构特征为：l 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片；若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片；l 所有肽键的所有肽键的C=O和和NH形成链间氢键；形成链间氢键；l侧链基团分别交替位于片层的上、下方。侧链基团分别交替位于片层的上、下方。l-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所也可以在同一肽链的不同部分之间形成

47、。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。接近垂直。l-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的的N-N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。两条肽链的方向相反。l永 久 性 卷 发永 久 性 卷 发(烫 发烫 发)是 一 项 生 物 化 学 工 程是 一 项 生 物 化 学 工 程(biochemical engineering),(biochemical engineering),角蛋白在湿角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为热条件下

48、可以伸展转变为 构象，但在冷却构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。干燥时又可自发地恢复原状。l这是因为这是因为 角蛋白的侧链角蛋白的侧链R R基一般都比较大，基一般都比较大，不适于处在不适于处在 构象状态，此外构象状态，此外 角蛋白中的角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺螺旋构象旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。基础。l多肽链多肽链180回折部分，通回折部分，通常由四个氨基酸残基构成，常由四个氨基酸残基构成，借借1、4残基

49、之间形成氢键维残基之间形成氢键维系。系。l这类结构主要存在于球状蛋这类结构主要存在于球状蛋白分子中。白分子中。肽链主链出现的肽链主链出现的180回折回折部分称部分称-转角。转角。无规则卷曲无规则卷曲细胞色素细胞色素C的二级结构的二级结构2、超二级结构、结构域、超二级结构、结构域超二级结构超二级结构(supersecondary structure)（1）在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。上能辨认的二级结构组合体。（2）类型：）类型：

50、、锌指结构、亮氨酸拉链、锌指结构、亮氨酸拉链超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域聚集成具有功能的结构域1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -链链-迂回迂回回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构-迂回迂回COOHNH2识别螺旋识别螺旋Zn2+PheHisHisArgCysCysLeu锌指基元中锌指基元中Cys和和His残残基构成结合锌的位点基构成结合锌的位点锌指与锌指与DNA的作用的作用DNA锌指锌指Ca2+Ehelix FhelixEF l主链骨架围绕中心轴盘绕主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；形成右手螺旋；