生物制药细胞工程单克隆抗体课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《生物制药细胞工程单克隆抗体课件.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物制药 细胞 工程 单克隆抗体 课件
- 资源描述:
-
1、1生物制药细胞工程单克隆抗体生物制药细胞工程单克隆抗体发明单克隆抗体技术发明单克隆抗体技术Nobel Prize in 1984Nobel Prize in 1984抗体发展的三个阶段抗体发展的三个阶段单克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体多克隆抗血清多克隆抗血清传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234细胞工程杂交瘤技术鼠单抗鼠单抗人单抗人单抗大鼠大鼠小鼠小鼠产量高、操作比小鼠麻烦产量高、操作比小鼠麻烦 少用少用易操作、多用易操作、多用HAMAHAMA反应反应人人杂交瘤人人杂交瘤人人B B细胞、骨髓瘤细胞融合细胞、骨髓瘤细胞
2、融合人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤人人B B细胞、鼠骨髓瘤细胞融细胞、鼠骨髓瘤细胞融合合杂交瘤制备人单抗的问题:染色体易丢失、抗体分泌不稳定杂交瘤制备人单抗的问题:染色体易丢失、抗体分泌不稳定n美国已上市美国已上市16种单克隆抗体药物种单克隆抗体药物n 2002年销售额年销售额 29亿美元亿美元n 2005年年 90亿美元亿美元n 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。n2002年完全人源化单抗年完全人源化单抗humira获得批准上市,这是单克隆抗体药物发展具有里程碑获得批准上市,这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事,预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代
3、的来临。意义大事,预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。Humira是是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。Avastin 是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物,也是第一个从抗体库中筛选出的是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物,也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。段抗体药物。Avastin的上市使公司的股价上升了的上市使公司的股价上升了90亿美元。亿美元。抗血小板凝集的原理图抗血小板凝集的原理图全球有超过全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体家上市或未上市公
4、司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司(正在进行临床试验的抗体公司(38家):家):AbgenixAlexion PharmAltarexApplied Molecular EvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(Cambridge Ab Tech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson)ElanElsaiEli LillyGenzyme TransgenicsGenentechGenmabHoffman-La RocheICOS PharmIDEC Pharm/MitsubishiImClo
5、ne SysImmunotechKaneboKnoll PharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrtho BiotechPasteur-MerieuxProgenicsProtein Design LabScheringSmithKline BeechamTanox BiosystemsTechnicloneXomaZenyakuProductsSquibbSDA批准进入临床的体内诊断用抗体批准进入临床的体内诊断用抗体 131I-抗人肝癌单克隆抗体抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1)99mTc-抗人小细胞肺癌单克隆抗体(抗人小细胞肺癌单克隆
6、抗体(2F7)SDA批准进入临床的治疗用单抗批准进入临床的治疗用单抗抗抗T细胞免疫毒素细胞免疫毒素抗抗C-ALL免疫毒素免疫毒素131I-抗肝癌单克隆抗体抗肝癌单克隆抗体抗人抗人CD25单克隆抗体单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗流行性出血热抗体抗流行性出血热抗体抗人抗人CD3单克隆抗体单克隆抗体抗人抗人IL-8单克隆抗体单克隆抗体抗体治疗疾病的机制抗体治疗疾病的机制n抗原失活n免疫效应细胞吞噬n抗原表面弱化易受补体破坏单抗研发的演变历程单抗研发的演变历程鼠单抗鼠单抗100%鼠源鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠鼠/人嵌合单抗人嵌合单抗(66-75%人源人源)ReoPro,
7、RituxanRemicadeSimulect人源化单抗人源化单抗(90-95%人源人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis100%人源人源 每個每個 抗原決定基抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体至少誘生一種專一性抗体1 多克隆抗血清多克隆抗血清对健康人用疫苗进行主动免疫,对健康人用疫苗进行主动免疫,免疫前(免疫前(a a)和免疫后)和免疫后1010天天 (b b)分别采血并对血清蛋白进行凝胶分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的电泳分析。免疫前血清中的g g 球球蛋白条带较宽,免疫之后则相对蛋白条带较宽,免疫之后则相对集中。集中。
8、Bruton Bruton 氏病患者血清蛋白氏病患者血清蛋白中的中的 球蛋白条带缺失(球蛋白条带缺失(c c)。)。a a1 a a2b b 白蛋白白蛋白球蛋白球蛋白(c)(a)(b)来源来源:组织和细胞,其成分比较复杂。组织和细胞,其成分比较复杂。1.1.组织和细胞成分混合抗原制备组织和细胞成分混合抗原制备 2.2.蛋白质抗原制备蛋白质抗原制备 3.3.核酸抗原制备核酸抗原制备 4.4.类脂多糖抗原制备类脂多糖抗原制备 5.5.免疫球蛋白片段制备免疫球蛋白片段制备 6.6.纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定 二、可溶性抗可溶性抗原制备及鉴定原制备及鉴定可溶性抗原可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、
9、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸返回返回 组织和细胞成分混合抗原制备程序组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液上清液澄清澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结去除包膜或结缔组织缔组织脏器进行灌洗脏器进行灌洗洗去血迹洗去血迹及污物及污物NSNS内含内含0.5g0.5gL NaNL NaN2 2冷浴中组织剪碎冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液粉碎制成组织匀浆液3000r3000rminmin10min10min取上清液取上清液去除细胞碎片去除细胞碎片及微小组织及微小
10、组织离心离心 绵羊红细胞的制备流程图绵羊红细胞的制备流程图 摇动摇动15-20min15-20min 44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%细菌细胞抗原的制备流程图细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原返回返回杂交瘤技术过程杂交瘤技术过程多价抗原多价抗原单克隆单克隆(致敏的(致敏的B细
11、胞)细胞)单克隆抗体单克隆抗体癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個 B cell 只只产产生一生一种种抗抗体体 一一个个 B 细细胞只能生胞只能生产产一一种种抗体,抗体,对对付某一付某一 抗原決定基。抗原決定基。BBBYYYY抗 原BYB11Y22Y33Y441234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开1234mmmm1234YYYYYYYYYmm核酸 抗体
12、X-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫 抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集 B 細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次Ag X-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤细胞(Subcloning)(确定只有一种细胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对
13、抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原抗体的结构抗体的结构1 小分子抗体小分子抗体3 鼠单抗人源化鼠单抗人源化基因工程改造的抗体基因工程改造的抗体2123小分子抗体小分子抗体FabFab:抗原结合片断:抗原结合片断FvFv:可变区片段:可变区片段ScFvScFv:单链可变区片段:单链可变区片段SdAbSdAb:单区抗体:单区抗体 免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体链表达载体L链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CL图图5 Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备I Fab antibody molecule抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-
14、CH1图图5 Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备II Fv antibody molecule双特异性抗体双特异性抗体 抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点,使抗许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点,使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起,可使效应细胞更容易与肿瘤细胞子的抗体连结在一起,可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识
15、别,取得杀伤肿瘤细胞的作用。结合识别,取得杀伤肿瘤细胞的作用。CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B 抗原结合部位与生物活性蛋白结合抗原结合部位与生物活性蛋白结合 含含FcFc段的抗体融合蛋白段的抗体融合蛋白免疫黏附素免疫黏附素 FcFc的作用:检测、纯化、的作用:检测、纯化、延长血清中半寿期延长血清中半寿期 生物学效应功能生物学效应功能G-CSFFcFusion ProteinDNA ligationexpressionFcFc的作用:延长血清中半寿期的作用:延长血清中半寿期将小鼠将小鼠IgIg基因敲除,转染人基因敲除,转染人IgI
16、g基因,在小鼠体内产生人基因,在小鼠体内产生人AbAb,再经杂交瘤技术,产生大量完全人,再经杂交瘤技术,产生大量完全人源化抗体源化抗体鼠单抗人源化鼠单抗人源化Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠VL人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人-鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体定义:指利用基因工程技术,将人抗体可变区(定义:指利用基因工程技术,将人抗体可变区(V V)中互补决定簇
17、()中互补决定簇(CDRCDR)序列改换成鼠源单抗)序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重构重构型抗体型抗体”,因其主要涉及,因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”,又可称为,又可称为“CDRCDR移植抗体移植抗体意义:多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗意义:多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗 人源化抗体又称人源化抗体又称CDRCDR移植抗体移植抗体CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体
18、图图4 鼠单克隆鼠单克隆V区人源化(区人源化(CDR移植)移植)u 抗体库抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)(repertoire)三三 基因工程方法研制新的单抗基因工程方法研制新的单抗接头接头DNADNAVH VLVH VL图图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因基因IIIIII或基或基因因VIII VIII 外壳蛋白外壳蛋白 VHVHVL定义:将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体,转染工程细菌进行表达,然后定义:将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体,转染工程细菌进行表达,然后用抗原筛选即可获得特异
19、的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体,在的抗体,在HIVHIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术用用PCRPCR扩增人抗体重链可变区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使
20、抗体基因以分泌的方式表达,获得可溶性的抗体片段。使抗体基因以分泌的方式表达,获得可溶性的抗体片段。抗体库:抗体库:组合抗体文库:在建库过程中如果将组合抗体文库:在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库:抗体人天然抗体库:抗体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人(一)基本原理和程序(一)基本原理和程序噬菌体抗体库噬菌体抗体库从外周血或脾、淋巴结等组织中分离从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B B淋巴细胞,提取淋巴细胞,提取mRNAmRNA并逆转录为并逆转录为cDNAcDNA;应用抗体轻链和重链引物,根据建库的需要通过应用抗体轻链和重链引物,根据建
展开阅读全文