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1、基因诊断培训讲义基因诊断培训讲义 几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后预后 基因诊断：是以基因诊断：是以DNADNA或或RNARNA为诊断材料，通过检查为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和

2、疾基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。病作出诊断的方法和过程。2基因诊断培训讲义 第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为基础，通过限制性片段长度多态性性（RFLP)分析进行 第二阶段：应用PCR技术 第三阶段：应用基因芯片技术3基因诊断培训讲义一一 .基因诊断中常用的几种技术基因诊断中常用的几种技术（一）（一）核酸杂交核酸杂交（二）（二）PCRPCR（三）三）DNADNA序列测定序列测定（四）（四）DNADNA芯片技术芯片技术4基因诊断培训讲义(1)(1)方法方法:以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已

3、杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.(2)2)几种不同形式的核酸分子杂交几种不同形式的核酸分子杂交 a.Southern印迹(southern blot)杂交:用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b.Northern印迹(Northern blot)杂交:用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c.斑点杂交（dot blot):既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低5基因诊断培训讲义d.原位杂交（in situ hybri

4、dization):e.f.是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断g.分类:玻片原位杂交:如中期的染色体和组h.织切片.i.膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼 j.龙膜(如硝酸纤维膜)k.6基因诊断培训讲义7基因诊断培训讲义（）等位基因特异性寡聚核苷酸（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele allele specific oligonnucleotide,ASO)specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：探针斑点杂交：PCR-ASOPCR-ASO该方法是

5、该方法是诊断已知点的突变：诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用针在基因诊断时，只需用PCRPCR扩增受检者目的扩增受检者目的DNADNA片段，再片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不 存在这种突变；只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发 现的类型8基因诊断培训讲义（）单链构象多态性（）单链构象多态性（single strand singl

6、e strand conformation ploymorphism,SSCP)conformation ploymorphism,SSCP)分析分析9基因诊断培训讲义 基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.10基因诊断培训讲义 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 RFLPs(restriction fragment length polymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人

7、以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱11基因诊断培训讲义 双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变12基因诊断培训讲义 在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进

8、行甲基化特异性PCR设计一对甲基化特异性引物（引物中甲基化特异性引物（引物中G G结合模板中结合模板中C);C);和非甲基化特异性引物（引物中和非甲基化特异性引物（引物中A A结合模板中结合模板中U),U),通过通过PCRPCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的的DNADNA序列和非甲基化等位基因序列序列和非甲基化等位基因序列用于一些疾病和肿瘤的基因诊断用于一些疾病和肿瘤的基因诊断13基因诊断培训讲义 定量PCR(quantiative PCR,Q-PCR):就是对靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分子数N=N

9、o(1+E),其中E是指每次循环中参与复制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求出No.但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较多.n14基因诊断培训讲义 a.通过测定PCR产物量 方法:对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还可对未知量的靶DNA进行绝对定量.b.采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析:方法:将待测DNA标本进行倍数稀释,直至扩增不到靶基因的稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数的相对量,是一种半定量方法.15基因诊断培训讲义 c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析 方法:该方法是在一个试管内同

10、步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA的用量、可扩增性和管间扩增效率的变化,通过比较两段序列PCR扩增产物电泳带的荧光强度,对靶序列进行定量分析 d.采用竞争抑制法对靶核酸进行定量分析:方法:参照标准不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,与待测序列具有相同的引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子.方法:将竞争模板作系列稀释后加入恒量的样品DNA进行PCR扩增,通过分离和分析竞争模板和样品DNA的PCR产量,对样品DNA进行定量分析16基因诊断培训讲义 e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通

11、过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点.FQ-PCR技术的两种定量形式:绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量.如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确.相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin,rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素.17基因诊断培训讲义 1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，

12、产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质18基因诊断培训讲义 DNADNA芯片（芯片（DNA chip)DNA chip)又称为基因芯片，又称为基因芯片，DNADNA微阵列微阵列（DNA microarray)DNA microarray)该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA

13、微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。19基因诊断培训讲义一.通过致病基因的检测诊断疾病 已经基本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制，相关的基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。如：一些与疾病有关的内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。诊断方法：根据突变的基因序列设计探针.20

14、基因诊断培训讲义 许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。21基因诊断培训讲义40-60年代:功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能相关的线索确定与疾病相关的基因:如苯丙酮尿症与镰刀型的贫血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色体-基因的反向遗传学策略对没有明显的表型或生化功能异常的疾病.90-今 :表型克隆

15、,不考虑基因在染色体上的位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异.22基因诊断培训讲义表型克隆：对疾病相关的一组基因进行克隆 一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。不可能通过前面的方法来诊断，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间的差异序列，鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。方法：根据克隆到的一组基因制作相应的一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关的基因来诊断多基因病23基因诊断培训讲义一.遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变

16、的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆.2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.24基因诊断培训讲义短串联重复序列短串联重复序列STRs (short tendem repeats,Microsatellites)STR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是基本单位是1bp-8bp的的串联重复，串联重复，重复次数重复次数 n=15-60，已知，已知8000多个，多个，主要形式为：主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以其中以(CA)n，(GT)n 为多见。为多见。1992

17、年，年，Welssenbanch等以等以STR为标记的为标记的第二代连锁图取代了第二代连锁图取代了RFLP连锁图连锁图。26基因诊断培训讲义 定义定义:主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的变异所引起的DNADNA序列多态性。序列多态性。与与RFLPRFLP与与STRSTR不同不同,它是直接以序列的变异作为标记它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的而不是以片段的长度差异作为标记长度差异作为标记.人类基因组图谱的初步分析表明，共有人类基因组图谱的初步分析表明，共有3 3万万至至3.53.5万个基因。有万个基因。有300300多万个单核苷酸多态多

18、万个单核苷酸多态性性,SNP,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每在人类基因组中广泛存在，平均每50050010001000个碱基对中就有个碱基对中就有1 1个，个，3-43-4个相邻的标记构成个相邻的标记构成的单倍型（的单倍型（haplotypehaplotype）就可有）就可有8-168-16种。种。19961996年，年，LanderLander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性 标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphismsingle nucleotid pol

19、ymorphism，SNPSNP）27基因诊断培训讲义 SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间.28基因诊断培训讲义 分为异常血红蛋白病和地中海贫血分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋前者是由于珠蛋白的基因突变；后者

20、是由于珠蛋白合成速率降低，白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a a链和链和b b链合成不平衡。链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断：（一）异常血红蛋白病的基因诊断：如镰状红细胞贫血病如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基链第六位氨基酸酸:GAA(:GAA(谷谷)GUA()GUA(颉颉)代替代替.对该病的基因诊断应采用对该病的基因诊断应采用:1)PCR+1)PCR+限制酶切限制酶切,即用即用PCRPCR从患者基因组扩增含突变从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化再选适当的内切酶消化PCRPCR产物产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断

21、根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 2)Southern 印迹杂交分析印迹杂交分析29基因诊断培训讲义（二）（二）地贫的基因诊断：地贫的基因诊断：1 1.定性分析：定性分析：PCRPCR法直接扩增法直接扩增11和和22 基因的基因的33端有差别，针对此可设计端有差别，针对此可设计 引物进行引物进行PCRPCR，如有缺失，则不能扩如有缺失，则不能扩 增出产物增出产物 2 2.定量分析定量分析:地贫的共同特点是地贫的共同特点是 珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的量减少，因此可用的量减少，因此可用 RT-PCR RT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断的量以助诊断

22、30基因诊断培训讲义 （三）（三）-地贫的基因诊断地贫的基因诊断 1 1.DN.DN检测与分析检测与分析 ：PCR+ASO PCR+ASO 探针法探针法 为主要方法为主要方法 根据根据 -珠蛋珠蛋 白主要突变位点，设计白主要突变位点，设计2 2对引物，扩增可能发生对引物，扩增可能发生 突变的突变的2 2个片段个片段,再分别与相应野生型探针和突再分别与相应野生型探针和突 变探针进行斑点杂交。变探针进行斑点杂交。PCR+RFLP PCR+RFLP连锁分析法连锁分析法 检测与检测与-珠蛋白基因连珠蛋白基因连 锁的遗传标记进行基因诊断锁的遗传标记进行基因诊断,如如-珠蛋白珠蛋白55端端 有一限制内切酶

23、有一限制内切酶HgiAIHgiAI的多态性位点的多态性位点,在中国人在中国人 群的频率为群的频率为0.5 0.5 DNA DNA芯片技术芯片技术 2 2.RNA.RNA检测与分析：检测与分析：RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊的量以助诊 断断31基因诊断培训讲义 DMDDMD：是性连锁隐性遗传病是性连锁隐性遗传病,是由是由抗肌萎缩蛋白抗肌萎缩蛋白(dystrophin)(dystrophin)基因突变基因突变(突变或缺失突变或缺失).).其突出其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMDDMD相对更为常见。相对更为

24、常见。DMDDMD患儿在患儿在5 5岁前发病，岁前发病，2020岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约率在男性活婴中约1/3500 1/3500。32基因诊断培训讲义1.RFLP连锁分析:通过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁的DNA多态性,并将其作为遗传标记追踪多态性在家族成员中的传递.2.基因组DNA探针法:用突变高发区的常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因的相应变异.3.cDNA探针法:用较短的抗肌萎缩蛋白基因cDNA作为探针.比2方便、检出率高.4.多重PCR法:对基因突变较集中的区域,设计多对引物,扩增基因相应的突变高发区,

25、检测相应的基因突变.33基因诊断培训讲义 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略略.一一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤淋巴造血系统肿瘤:染色体易位及基因融合染色体易位及基因融合是较普遍的现象是较普遍的现象.如如:淋巴瘤和淋巴结反应性淋巴瘤和淋巴结反应性增生增生.它是由于它是由于T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)基因和基因和IgHIgH基基因重排因重排

26、,使原来相隔数百个碱基的使原来相隔数百个碱基的IgHIgH和和TCRTCR基因的基因的V V区和区和J J区靠近在一起区靠近在一起.用用PCRPCR扩增该区扩增该区域片段域片段,通过长度分析就能判断是否发生了通过长度分析就能判断是否发生了基因重排基因重排.34基因诊断培训讲义 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤:ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突

27、变.ras癌基因点突变检测方法:a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类 型。b.PCR-SSCP法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。35基因诊断培训讲义 2.P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基 因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有 p53基因突变。突变类型：130290密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。基因检测方法：PCR-S

28、SCP:可检出有无突变 PCR-RFLP:通过内切酶位点的消 失或增加检测p53的基因突变。36基因诊断培训讲义 已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:Burkitt 淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤.EB病毒37基因诊断培训讲义肿瘤标志物（tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表

29、达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。基因诊断方法：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。38基因诊断培训讲义 每种病原体都有各自特异的遗传物质每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是可以是DNA,DNA,也可以是也可以是RNA.RNA.每种病原生物都

30、有各自种属特异的每种病原生物都有各自种属特异的基因基因.一一.病毒感染性疾病的诊断病毒感染性疾病的诊断 a.a.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒:目前采用免疫法检测血清中病毒目前采用免疫法检测血清中病毒抗原抗原.HBV HBV基因组包含基因组包含4 4个开放阅读框个开放阅读框,S,S、C C、P P和和X X区区,C,C区变异性小区变异性小,是基因诊断采用的目标部位是基因诊断采用的目标部位.在用在用PCRPCR检测时可扩增检测时可扩增HBVHBV的特异核苷酸序列的特异核苷酸序列,通过通过PCRPCR产物产物的直接电泳分析的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或内切酶谱分析、或点杂交、或或South

31、ernSouthern印迹等结果作出判断印迹等结果作出判断.也可采用基因芯也可采用基因芯片技术片技术.39基因诊断培训讲义 b.b.传染性非典型肺炎传染性非典型肺炎(SARS):(SARS):是由新型变异冠状病毒是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)(SARS-CoV)感染引起感染引起.SARS-CoV.SARS-CoV基因组为正链单股基因组为正链单股RNA,RNA,有有1111个开放阅读框个开放阅读框,基因组的特异基因组的特异保守序列为编码保守序列为编码RNARNA聚合酶的序列聚合酶的序列.基因诊断方法基因诊断方法:采用采用RT-PCRRT-PCR技术扩增保守序列技术扩增保守序列 DNADNA芯片芯片二二.诊断细菌感染性的疾病诊断细菌感染性的疾病 用用PCRPCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物设计引物,检测引起的疾病的细菌类型检测引起的疾病的细菌类型.40基因诊断培训讲义一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性.3.伦理问题二.发展前景41基因诊断培训讲义