非洲猪瘟实验室诊断课件.ppt

1、非洲猪瘟实验室诊断国家外来动物疫病研究中心国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心中国动物卫生与流行病学中心African Swine Fever,ASF定义非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。世界动物卫生组织世界动物卫生组织 可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%临床上，与古典猪瘟

2、非常相似，难以区分 目前没有疫苗！目前没有疫苗！2017/5/15 只感染猪 家猪和欧亚野猪非常易感 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者 非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状 软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播 媒介 法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。2017/5/15重要性重要性OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病我国动物疫病名录一类动物疫病我国中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）明确重点防范的外来动物疫病病原病原非洲猪瘟病毒科中唯一成员 Asfarviridae Asfivirus ASFV兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性唯一核酸为DNA的虫媒病毒只有一个血

3、清型特点之一：基因组大170190kb170190kb蓝耳病病毒15kb 12 倍猪瘟病毒12kb 15 倍Genome CSFV口蹄疫病毒8kb 24 倍Genome FMDV病原病原病原特点之二：基因多变基因组两端各有一个高变区，基因型多达22个特点之三：抵抗力强温度：6020分钟；5670分钟25-37 数周4 1年冻肉冻肉数年到数十年数年到数十年pH：411.5 无血清413.4 有血清有血清未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活病原乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活临床症状最急性型急性型亚急性型慢性型2017/5/15临床诊断最急性型无临床症状，突然死

4、亡急性型（强毒株）发烧（41-42C）食欲减退 不愿活动 局部皮肤变红或变蓝色 腹泻 呕吐 呼吸困难 流产 死亡率高（10-100%）仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。Mityana,Uganda,2010临床诊断亚急性型（中等毒力毒株）症状同急性型，但较轻 死亡率低 持续时间长（3周）慢性型（低毒力毒株）消瘦或发育迟缓，体弱 偶见体温升高，波状热 呼吸困难，湿咳 怀孕母猪流产 多处皮肤局部红斑、溃疡 耳部、腹部、大腿内侧可能凸起或坏死 易继发感染，如继发引起肺炎和关节炎 感染后能康复，但终身带毒 死亡率低，可见血清转阳临床诊断各种毒力的毒株均可导致流产胎儿可能全身水

5、肿胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点诊断病理诊断脾脏肿大 易碎暗红色至黑色胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；水肿肺、肝、膀胱胆囊充盈结肠系膜肾皮质出血点、出血斑出血瘀点瘀斑慢性型纤维素性心包炎，并可见出血点肺局部肉变，实变肺部局部肉芽肿，形成结节图1：ASF 猪尸体底部的发绀病变。图2：耳尖的发绀病变。图图3 3：血性腹泻血性腹泻（血痢）。（血痢）。图图4 4：急性：急性ASFASF 死猪肺小叶间的水肿。死猪肺小叶间的水肿。图图5 5：胃的基底膜淤血（急性）：胃的基底膜淤血（急性）图图6 6：典型肿大脆化脾。：典型肿大脆化脾。（黑浆果脾，急性（黑浆果脾，急性ASF）图图7 7：病猪脾（上）与

6、正常脾大小的比较。（急性：病猪脾（上）与正常脾大小的比较。（急性ASFASF）图图8 8：急性：急性ASFASF 猪肿大的褐色脾。（巴西品种）猪肿大的褐色脾。（巴西品种）图9：肾淤斑及出血点（急性）图图1010：肾盂及肾乳头部的出：肾盂及肾乳头部的出血斑（急性）血斑（急性）图图1111：肾盂处散在的出血点（急性：肾盂处散在的出血点（急性ASFASF）图图12：肿大、出血的肝胃淋巴结，可出见有血凝块。（急性）：肿大、出血的肝胃淋巴结，可出见有血凝块。（急性）图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF）图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）图图1515：胆囊水肿（急性：

7、胆囊水肿（急性ASFASF）图图1616：肺部可见肉芽肿病变，：肺部可见肉芽肿病变，形成一结节（慢性形成一结节（慢性ASFASF）图图1717：肺实变区（慢性：肺实变区（慢性ASFASF）图图1818：心包脏层附有纤维素，：心包脏层附有纤维素，而且可见出血点（慢性而且可见出血点（慢性ASFASF）鉴别诊断 高致病性蓝耳病 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起 细菌性败血症 香豆素中毒 真菌毒素中毒。2017/5/15VirusVirusAbAb感染表现出临床症状携带者病毒血症病毒血症:感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月）特异性抗体特异性抗体:从感染后的7-11天至数月，甚至数年排

8、毒排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间。甚至康复后。ASF感染的主要特征猪猪 (野猪和家猪野猪和家猪)软蜱软蜱实验室诊断实验室诊断病原学血清学病毒分离 血细胞吸附试验直接免疫荧光法（FAT）普通PCR和荧光定量PCR双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原间接ELISA测定ASF 特异性抗体阻断ELISA检测ASF 特异性抗体唯一确诊单位：国家外来动物疫病研究中心唯一确诊单位：国家外来动物疫病研究中心免疫印迹间接免疫荧光测抗体实验室诊断血清样品血清样品析出的血清不合格血液样品分离好的血清单独 包装，并一一编号合格血液样品实验室诊断病原学样品病原学样品抗凝血淋巴结脾脏肾脏骨髓实验室诊断的安

9、全原则 保障人员的安全 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食 物和饮料等 了解化学试剂的特性和潜在的危险 保障样品的安全 防止样品交叉污染 一次性手套2017/5/15良好的工作区域 第一步 实验前清洁试验区域（台面、移液器等）注意消毒剂的期限 第二步划分不同的区域 样品处理（BSL-3提取病毒DNA）PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等）ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）2017/5/15GLP(good laboratory practice)原则原则制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性，可核查结论和可追溯性数据的报告。要点要点

10、资源：组织、人员、设施和设备 特征：检测项目和测试系统 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP）结果：原始数据、最后报告和档案 质量保证：独立监测的研究过程2017/5/15实验室诊断技术储备278bp257bp英国Pirbright 实验室比对实验建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量PCR鉴别诊断方法双抗体夹心ELISA检测抗原阻断ELISA检测抗体间接ELISA检测抗体间接ELISA检测病毒抗原商品化试剂盒INGEZIM K3(Ingenasa,Spain)价格比PCR便宜不需要复杂的操作适用于基层实验室敏感性低（慢性或亚急性）2017/5/15分子生物学检测方法O O20u17r/a5,/1C5

11、.A.,L.Edwards,and C.A.Batten.2013.Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests.Virus research 173:150-158.荧光PCR检测病毒DNA荧光PCR工作单样品的可追溯性！2017/5/15荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备病毒DNA提取试剂盒非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒荧光PCR检测病毒DNA-试剂制备冻干蛋白冻干蛋白酶酶K:将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的 蒸馏水中，将溶液以500 l分装，在-10C温度下 储存，

12、直到使用。除抑制物缓冲液除抑制物缓冲液:将20ml无水乙醇加入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。室温储存。冲洗缓冲液冲洗缓冲液:将80ml无水乙醇加入原瓶中混匀并 进行相应的标记和日期记录。室温储存。荧光PCR检测病毒DNA-仪器设备水浴锅或金属浴匀浆仪和匀浆管（陶珠）台式离心机荧光PCR仪移液器荧光PCR检测病毒DNA-样本处理组织样本取100 mg组织剪碎，加入1mlPBS研磨或匀浆，然后1050g或2000rpm离心10分钟取上清全血（抗凝血）或血清直接吸取200 l提取病毒DNA 将200 l结合缓冲液（绿盖）和40 l蛋白酶K（20mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。加

13、入200 l样本。每个提取程序都加入E+和 E-(200 l水)对照。立即混匀并在722C 温度下孵育10分钟。将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的 水珠。将100 l异丙醇加入样本试管，混匀。异丙醇加入样本试管，混匀。将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。提取病毒DNA（2）将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中，重复离心操作。扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。将500 l除抑制物缓冲液（黑盖）放入过滤管，以8000 g离心1分钟。扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。将500 l冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。

14、扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 l冲洗缓冲液加入过滤管，以8000 g进行1分钟离心操作）。扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。提取病毒DNA（3）将50 l100 l预热的消毒蒸馏水加入过滤管（注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。将DNA溶液在-10C温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在43C温度下短暂储存，然后冻存。荧光PCR检测病毒DNAOIE方法配制反应体系：配制

15、反应体系：反应液溶解后，每个反应管中加入18 l反应液，然后再加入2 l模板；每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）荧光荧光PCR检测检测程序设置程序设置荧光PCR检测病毒DNA-实验结果荧光PCR检测病毒DNA-结果判定 有效性有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对 照（R-）无Ct值，则试验有效。阳性和阴性：阳性和阴性：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背 景信号之下或Ct值37时，判定为阴性结果。可疑样品：可疑样品：当样品的Ct值

16、大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。实时荧光RPA 重组酶聚合酶扩增技术 等温扩增（3742C）用时短：20分钟 灵敏度高 操作简单，便携式仪器2017/5/15实时荧光RPA检测ASFV 特异性强 与其他病毒无交叉反应 敏感性高 能检测出不同基因型的毒株2017/5/15实时荧光RPA检测ASFV2017/5/15 与荧光PCR具有较高的相关性 概率回归分析：最低可检测出17个拷贝ASFV的基因型22个基因型非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复 杂欧洲-I型意大利撒丁岛，II型东欧和

17、俄罗斯2017/5/152017/5/15血清学检测方法没有疫苗！抗体=感染没有中和抗体。感染早期既可以检测出抗体（7-12dpi）抗体持续很长时间2017/5/15血清学检测方法筛选（Screening by ELISA tests）1.OIE-ELISA 间接ELISA基于半纯化病毒抗原2.商业化ELISA试剂盒 INGEZIM PPA COMPAC K3(INGENASA)使用VP73特异性单抗的阻断ELISA SVANOVIR 间接ELISA（重组抗原p30蛋白）ID Screen 间接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白）2017/5/15确诊免疫印迹(Immunoblotti

18、ng)：半纯化病毒抗原间接免疫荧光（IFI）：E70毒株感染的传代细胞免疫过氧化物酶试验（IPT）：病毒感染的细胞对操作人员的要求较高血清学检测方法免疫印迹（IB）方法2017/5/15间接免疫荧光（间接免疫荧光（IIF）病毒感染细胞后加入待检测血清，再加入标 记荧光素的蛋白A。2017/5/15免疫过氧化物酶（IPT）非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒国家外来动物疫病研究中心研发使用p30蛋白的优点 适用于早期感染 敏感性和特异性较高Cubillos C,Gomez-Sebastian S,Moreno N,et al.Cubillos C,Gomez-Sebastian S,Moreno

19、 N,et al.2013.African swine fever virus serodiagnosis:a general review with a focus on the analyses of African serum samples.Virus Res 173:159-167.编号编号名称名称装量装量用法用法1预包被酶标板5块直接使用2酶标抗体（100）300L/管1瓶用稀释液做100倍稀释3阳性血清25L/管1管用稀释液做40倍稀释4阴性血清25L/管1管用稀释液做40倍稀释5稀释液55mL/瓶1瓶直接使用6洗涤液（20）100mL/瓶1瓶用双蒸水做20倍稀释，按0.5比例加

20、入吐温-207吐温-201.5mL/管1管直接使用8底物溶液30mL/瓶1瓶直接使用9终止液30mL/瓶1瓶直接使用组分与用法组分与用法非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒原理ASFV重组p30蛋白作为抗原包被奇数条作为检测孔，使用 抗原稀释液包被偶数条作为对照孔，样品同时加入到检测 孔与对照孔中，所测OD值之差用于结果判定。非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒123456789101112AS5S5BS6S6CS7S7DS8S8ES1S1S9S9FS2S2S10S10GS3S3S11S11HS4S4S12S12注：注：P表示阳性血清对照孔；N表示阴性血清对照孔；S1、S2、S3、S4等表 示

21、待检血清孔。检测步骤检测步骤1.待检血清与阴阳对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。2.在A1、A2和B1、B2孔中加入稀释后的阳性血清阳性血清，50L/孔。在C1、C2和D1、D2孔中加入稀释后的 阴阴性血清性血清，50L/孔。在E1、E2加入稀释后的待检血清待检血清，50L/孔。3.37孵育60min。4.弃去反应孔中的液体。每孔用洗涤液清洗4次，洗涤液（1）300L/孔。每次除去洗涤液后，在吸水 纸上拍打，除去残留的液体。5.每孔加入酶标抗体酶标抗体（1），50L/孔。6.37孵育30min。7.重复步骤4。8.每孔加入底物溶液底物溶液，50L/孔。9.室温避光作用10min。10.每孔中

22、加入50L终止液终止液，终止所有的反应。11.用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD450nm值，计算OD差。OD差差=OD奇数孔奇数孔-OD偶数孔偶数孔结果判定结果判定阳性对照OD差0.5，阴性对照OD差0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。待检样品OD差0.5，判为阳性。待检样品OD差0.5，判为阴性。非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒血清学诊断小结 商品化和OIE-ELISA对较高质量的血清样品 检测均有较为满意的效果。检测溶血样品时特异性和敏感性降低 阳性ELISA结果应该使用其他方法IPT、IIF 和IB验证。确定感染时间时，IPT和IIF是非常有用的工 具，是推荐的方法。

23、2017/5/15实验室诊断正确的非洲猪瘟诊断必须平行使用多种方法！血清学诊断方法（ELISA+IB+IIF或IPT）病毒学诊断方法确定是否含病毒核酸（PCR+病毒分离）2017/5/15外来病中心先后派出十余人次赴英国、美国、西班牙和非外来病中心先后派出十余人次赴英国、美国、西班牙和非 洲学习交流非洲猪瘟诊断与防控技术洲学习交流非洲猪瘟诊断与防控技术成功研制猪瘟与非洲猪瘟的快速鉴别诊断方法成功研制猪瘟与非洲猪瘟的快速鉴别诊断方法开展了大量病原学和血清学监测开展了大量病原学和血清学监测实验室检测278bp257bp英国Pirbright 实验室比对实验建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量建立了猪瘟、

24、非洲猪瘟的荧光定量PCRPCR鉴别诊断方法鉴别诊断方法骨髓培养物中淋巴结病毒分离血细胞吸附试验直接免疫荧光法测定抗原PCR和荧光定量PCR双抗体夹心ELISA测定抗原病病 原原 学学 检检 测测间接间接ELISAELISA测定测定ASFASF特异抗体特异抗体血清学检测血清学检测阻断阻断ELISAELISA检测检测ASFASF特异抗体特异抗体 间接免疫荧光测定特异抗体间接免疫荧光测定特异抗体 储储备了国际标准阻断备了国际标准阻断ELISA抗体检测试剂盒和竞抗体检测试剂盒和竞争争ELISA抗原检测试剂盒。抗原检测试剂盒。ELISA抗体检测试剂盒研究与储备 建立的方法在英国OIE参考实验室得到确认。参考资料 国际动物卫生法典-非洲猪瘟 陆生动物诊断试验和疫苗手册-非洲猪瘟 FAO 非洲猪瘟应急计划 AUSVETPLANDiseasestrategy ASF V4.0 非洲猪瘟 谢谢大家！Thank you very muchThank you very much！