修饰标记引物的介绍课件.pptx

1、 修饰引物的介绍修饰引物的介绍储存条件储存条件冻干引物和稀释成储液的引物建议储存在-20C.HEX,、TET和FAM对光敏感。应储存在黑暗处或用琥珀色管子储存。推荐放入黑色盒子中。染料 暴露在光下半衰期(大约)HEX 4.5 hoursTET 2.25 hoursFAM 1.125 hoursHEX和TET标记的寡核苷酸在PCR 30个循环内都是稳定的；但是在不利的环境中（高PH，高温），TET比HEX稳定。稀释方法稀释方法对于非Cy类的荧光标记引物，建议用TE稀释，浓度高于10uM。Cy3和Cy5标记的引物在碱性条件下易降解，用中性溶液溶解。稳定性稳定性 冻干的引物在-20C能够稳定一年。在

2、4度能够稳定几个月。储液在-20C能够稳定至少六个月，在4度能够稳定几个星期。AP偶联引物-放在AP储存液中运输，储存在4度，能够稳定12个月。HRP偶联引物-放在HRP储存液中运输，储存在4度，能够稳定12个月。修饰对修饰对ODOD值的影响值的影响 有些荧光基团在260 nm处也有吸收光:这些修饰包括：FAM,Fluorescein,HEX,TAMRA,and TET。其它在260 nm处可能也有吸收值，但是数据没有公布，因此计算时不包括在里面。AP and HRP偶联的寡核苷酸:蛋白和核苷酸都有OD值，但是可能不会影响寡核苷酸的真实OD值。合成规模和纯化方式合成规模和纯化方式Mod Syn

3、th Purification Purification Purification Purification Scale Desalted Cartridge HPLC Gel Purified 5 Biotin 5 Phosphate 5 Primary Amine 25 N Yes(10-50 bases)NO NO NO 50 N Yes(10-50 bases)NO NO NO 200 N Yes(10-50 bases)NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)1 U Yes(10-50 bases)NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 b

4、ases)25 U Yes(10-50 bases)NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)5 Rhodamine 25 N NO NO NO NO 50 N Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)200 N Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)1 U Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)25 U Yes(5

5、-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)5 HEX/TET/FAM 5 Fluorescein 5 GATEWAY 25 N Yes(10-50 bases)NO NO NO 50 N Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)200 N NO NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)1 U Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases

6、)25 U Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)AP Conjugate HRP Conjugate*25 N NO NO NO NO 50 N NO NO NO NO 200 N NO NO NO NO 1 U NO NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)25 U NO NO Yes(7 60 bases)Yes(7-100 bases)Phosphorothioates 25 N NO NO NO NO 50 N Yes(5-100 bases)Yes 7 60 bases

7、)YES(7 60 bases)YES(7-100 bases)200 N Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)YES(7 60 bases)YES(7-100 bases)1 U Yes(5-100 bases)Yes(7 60 bases)YES(7 60 bases)YES(7-100 bases)25 U Yes NO YES(7 60 bases)YES(7-100 bases)合成规模是25nnol时，合成的寡核苷酸不能小于10bp。问题：此表和网站上的不一致，是不是现在在中国不论合成规模大小，都能合成小于10bp的寡核苷酸呢？生物素生物素 生物素修饰能够

8、耐受热和pH（它能被加热到100度并暴露在pH2-10）。其它极端的环境可能也能耐受，但是还没有被检测。还原剂可能不会影响生物素修饰，但是没有精确的数据。生物素寡核苷酸通过OD260进行定量（生物素在260没有吸收光）。生物素化的DNA能够成功的转化进入细菌，如DH5 alpha。5-生物素没有相邻烃基，所以它比3-生物素稳定。3-生物素的化学结构可以预测3-Biotin可能会在两种情况下脱离或降解：1过期，2寡核苷酸暴露在碱性环境中如溶解在碱性缓冲液中。原因是3-Biotin有类似于RNA结构的相邻的烃基。5生物素3生物素 稳定性依次是：3-NH23-PO43-BIO。3生物素修饰的引物长度

9、不能大于99个核苷酸。因为3生物素是以CPG修饰的形式提供的（连接到固体支持物上），这个体系把3生物素连接到序列的最后一个核苷酸上。生物素dT：生物素dT是dT碱基上连有生物素，所以只有在5碱基是T时才能用生物素dT。生物素生物素问题：问题：生物素dT的分子式？5和3生物素修饰的合成过程（合成后、合成前）？通过什么连接键连接到寡核苷酸上？连接到寡核苷酸的什么位置（戊糖、碱基）？最终连接到寡核酸上的形式生物素生物素罗丹明罗丹明罗丹明溶解在水或TE中的颜色为粉红色，略成紫色。?罗丹明修饰不受合成规模的限制，它是合成后修饰。需要额外的纯化。?注：这个数据时染料溶解在甲醇中测定得到的。溶解在水或TE中

10、以及与寡核苷酸连接后的值是会变化的。罗丹明罗丹明问题：问题：现在中国地区能合成的罗丹明修饰有：5Rhodamine Green、5Rhodamine Red、5Rhodamine Red、3Rhodamine Red。Rhodamine Red、Rhodamine Green溶解在水中或TE中的颜色？5和3修饰时Rhodamine Green、Rhodamine Red的分子结构式？5和3修饰的方法：连接到戊糖还是碱基上？通过什么化学键连接？都是合成后修饰吗？合成后修饰：引物从固体介质上解离之后经过纯化再进行修饰的？还是引物合成之后在固体介质上直接进行修饰？修饰之前需要纯化吗？修饰之后需要纯化

11、吗？最终连接到寡核酸上的形式5 5 HEX,TET or 6-FAMHEX,TET or 6-FAMHEX is 4,7,2457 hexachlorofluoresceinTET is 274,7,tetrachlorofluoresceinFAM is 6-carboxyfluorescein FAM,HEX and TET是在合成循环结束时以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学作用添加上的，因此是添加到引物的5末端的糖上而非引物的末端碱基。它们通过磷酸二酯键共价连接到5端最末的糖环上。在液体中的颜色：HEX是粉红色，FAM是黄色，TET是橙色 经过这些修饰的寡核苷酸不能进行硫代磷酸化修饰。H

12、EX,TET or 6-FAMHEX,TET or 6-FAM注：摩尔消光系数是在最大nm处的激发光下测得的。因为pH或成分的微小变化可能会影响以上的数据，染料的颜色取决于ABI仪器上的“滤光片设备”：Dyes Filter A Filter BHEX Green(560nm)Yellow(560nm)6-FAM Blue(531nm)Blue(531nm)TET -Green(545)问题问题:3 HEX,TET or 6-FAM修饰的结构式？3HEX,TET or 6-FAM修饰时是连接到戊糖还是碱基上？连接键是什么？3HEX,TET or 6-FAM是合成后修饰吗？3HEX,TET or

13、 6-FAM能否进行硫代磷酸化修饰？5和3 修饰的区别，如稳定性等？最终连接到寡核酸上的形式HEX,TET or 6-FAMHEX,TET or 6-FAM磷酸化磷酸化 5磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引 物5端的糖环上，而不是最后一个碱基上。？3磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成的第一个循环，碱基就与它偶联。它能够阻止聚合酶的延伸。稳定性：假设是DNA：3-PO4比3-BIO稳定。3-BIO在碱性环境下会脱落，而3-PO4不会。用胶纯化磷酸化引物时，不能区分全长引物和n-1引物，因为磷酸基团带阴性电荷，会影响电泳。有些经HPLC纯化后的磷酸化寡核苷酸在真空离心蒸发浓缩后有些“

14、脏”，或微黄。这可能是因为该产物为综合产物。在做QC时，通过乙醇沉淀可以去除。问题：问题：3磷酸化的结构式？连接键是什么？5磷酸化和3磷酸化的稳定性差异？5修饰的连接键？最终连接到寡核苷酸上的形式？磷酸化磷酸化Aminolinker5Aminolinker(C6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学反应添加到引物5糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5氨基标准的偶联效率是95%,氨基基团在260nm处是没有吸光值的；它在210nm处有吸光值。不能通过电泳检测它的存在（琼脂糖或丙烯酰胺）。3Aminolinker(C7)只与一些5修饰兼容，如FAM,HEX,TET,Fluo

15、rescein,Biotin,Amine,and phosphate。其它的5修饰(如Alexa dyes)需要氨基才能与寡核苷酸相连，这就无法避免该染料与3氨基相连。阻止连接或聚合酶延伸的一般想法是末端双脱氧法，但是这种方法昂贵或者不可用。因为只要根据应用去除3或者5，所以只需用3或5氨基修饰即可满足需要。另外氨基修饰是最简单最便宜的方法。任意一种氨基修饰都可以。5末端C6类型效果很好。用化学交联剂可以把双链DNA与肽连接。可以尝试用5伯胺修饰的DNA与戊二醛进行交联。问题：问题：5Aminolinker(C12)、5Aminolinker(C6)、3Aminolinker(C7)、dT C

16、6-Aminolinker、3Amino/Amine的分子式？3Aminolinker(C7)、3Amino/Amine的修饰过程？连接在核苷酸的什么位置？dT C6-Aminolinker的修饰过程？是不是只能在5端用这种修饰？这几种氨基修饰的区别？AminolinkerAlexa 它们都是通过C6连接臂与寡核苷酸连接的。3端通过氨基把Alexa连接到引物的3端。Alexa fluor染料是在合成后添加到寡核苷酸链上的。？问题：问题：5和3 Alexa Fluor的结构式？5和3 Alexa Fluor通过什么键和寡核苷酸连接？连接到戊糖还是碱基上？5和3 Alexa Fluor合成过程：合

17、成前修饰还是合成后修饰？5和3 Alexa Fluor的区别？Alexa Fluor Texas Red-X修饰基团是怎样被添加到寡核苷酸上的？首先在DNA的5末端的磷酸基团上加一个氨基，然后在氨基上连接一个带有羧基的基团。5-COOH-NH2-PO3-DNA问题：问题：5Texas Red-X、3Texas Red-X 的结构式？合成过程？合成前修饰还是合成后修饰？5Texas Red-X、3Texas Red-X通过什么键和寡核苷酸连接？连接到戊糖还是碱基上？水溶液的颜色？5Texas Red-X、3Texas Red-X的区别Phospothioate(S-oligos)S-oligos

18、 是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的。这种修饰是在连接的时候进行的（不是在合成后进行的）。碱基被添加上后，再进行连接修饰。在两个碱基之间的磷酸可以转换成双键“S”（用Beaucage试剂）代替普通的双键“O”（用碘溶液）。最终合成的寡核苷酸不是立体结构单一的形式，它们是R和S立体异构体的混合物。和磷酸二酯键相连的碱基都可以进行这种修饰。因为从固体支持物上解离下来时，3末端碱基是OH，不能进行硫代磷酸化。我们可以提供对S-oligo进行5修饰，如客户可以定制S-oligo的荧光素标记。我们不能提供在保存其它碱基“正常”的情况下使某些位置的碱基硫代磷酸化。这是由于法定

19、原因而不是化学合成的问题。S-oligo和普通的寡核苷酸在胶上的位置是一样的。用HPLC纯化方法纯化硫代磷酸化修饰的寡核苷酸时，带形双峰或者带形很宽。Phospothioate(S-oligos)Phospothioate的特性：化学稳定、在水溶液中稳定、能够抵抗核酸酶 应用：磷酸硫代的反义引物在体内通过很多不同的机制起作用。它们可以通过RNA水平抑制逆转录活性（抑制RNA病毒复制）。形成激活RNase H活性的底物S-ODNs和RNA形成双链，使RNA更容易被RNase H切断。反义寡核苷酸还能够直接干扰转录或抑制翻译。存在于胞内和血液/培养基中的核酸酶对S-Oligos的影响不大。因为S-

20、ODNs保持了寡核苷酸的带电状态，它们能够通过和阳离子脂类形成复合体而进入细胞。它们也存在转染率低的问题。反义引物在mRNA中的作用位点不同时，反义引物起的作用也不同（如寡核苷酸和mRNA上的转录起始密码子互补，敲降效果就很好）。Phospothioate(S-oligos)反义S-ODNS的概述/设计建议:典型的大小范围：14-30 mers.(很多文献是用20 mers的S-ODNs。质量范围是5000-11000。浓度范围（在培养基中）:15-25 uM(如果浓度大于这个范围会引起S-ODNS的非特异性毒性)。脂类介导的转化时的浓度范围：0.1-5 uM。(寡核苷酸的最适浓度应该由每个细

21、胞系和每个靶点分子决定)微注射时S-ODN的量:0.03-1 ug/ul 体内注射时S-ODN的量:0.05-1 mg S-ODN/Kg体重。磷酸硫代的键的数量：通常很多文献用的是每个碱基都做磷酸硫代连接。推荐的纯化方式:脱盐或HPLC或多重HPLC(反相和阴离子交换HPLC)。很多参考资料用HPLC纯化引物用于反义引物的研究。有一个参考文献比较了HPLC和脱盐纯化的寡核苷酸，发现没有区别。问题问题：Phosphorthioate(A/C/G/T)Phospothioate(S-oligos)5 Aldehyde5醛修饰用的化学试剂属于芳香族。它包含苯环。分子量是245。问题：问题：合成过程？

22、合成前修饰还是合成后修饰？连接在寡核苷酸的什么基团上？连接键是什么？5 Acrydite 5-Acryl 修饰的寡核苷酸能够使寡核苷酸和聚丙烯凝胶发生共聚反应。这个胶有一个或多个区域含有能够和特异序列互补的寡核苷酸。当含有互补序列的片段经过这些区域时，就会被捕获。这种修饰的寡核苷酸应用在突变检测、克隆筛选、样品制备和浓缩以及诊断。问题：问题：5Acrydite分子结构？5Acrydite合成过程？连接在寡核苷酸的什么基团上？连接键是什么？5-Thio-MODifier C6 S-S 巯基修饰的结构是：:HO-C6-S-S-C6-PO3-oligo 在用之前要用DTT使二巯基断裂，然后脱盐之后在

23、进行连接。把寡核苷酸溶解在100nM pH7.5 体积为900 ul的磷酸缓冲液中。加入100ulDTT，室温孵育1h。用脱盐的方法去除DTT和从寡核苷酸上脱离的保护基团。用缓冲液预先平衡NAP-10柱子加1 mL的样品用客户首选的1.5 mL缓冲液进行洗脱。立刻用于连接。问题：问题：5-Thiol-MODifier C6、3Thiol C3、3Thiol-C3 S-S 的结构式？5-Thio-MODifier C6 S-S、5-Thiol-MODifier C6、3Thiol C3、3Thiol-C3 S-S合成过程。连接到寡核苷酸的什么位置，连接键？5和3修饰的区别？5-Thio-MODi

24、fier C6 S-S 没有提到的修饰没有提到的修饰BHQ1、BHQ2、CY3、CY5、FITC、JOE、TAMRA、FAM dT、ROX AMCA、BODIPY、DABCYL、5DABCYL、Digoxin、Digoxin dT、5Spacer 18、3Eclipse、Deoxyinosine、Deoxyuracil、Me-dC、问题问题 各种修饰能合成的寡核苷酸的片段范围？各种修饰基团的化学结构 各种修饰基团的外观 合成过程：合成后/合成前、通过什么连接键进行连接、合成后修饰基团的结构式、连接在寡核苷酸的什么位置、通过什么键和寡核苷酸连接。合成后修饰：引物从固体介质上解离之后经过纯化再进行修饰的？还是引物合成之后在固体介质上直接进行修饰？修饰之前需要纯化吗？修饰之后需要纯化吗？3和5修饰稳定性比较 Phosphorthioate(A/C/G/T)Thanks