环境工程微生物学实验课件.ppt
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- 环境工程 微生物学 实验 课件
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1、环境工程微生物学实验环境工程微生物学实验实验一实验一 一、显微镜的结构一、显微镜的结构显微镜显微镜机械部分机械部分光学部分光学部分镜座、镜柱、镜臂、镜座、镜柱、镜臂、镜筒镜筒倾斜关节、转换器倾斜关节、转换器载物台载物台目镜、物镜目镜、物镜遮遮光器光器反光镜反光镜二二.显微镜的使用显微镜的使用一、取镜和安放一、取镜和安放1 1右手握住镜臂,左右手握住镜臂,左手托住镜座手托住镜座 2 2把显微镜放在实验台上,把显微镜放在实验台上,略偏左(显微镜放在距实验略偏左(显微镜放在距实验台边缘台边缘7 7厘米左右)。安装厘米左右)。安装好目镜和物镜。好目镜和物镜。显微镜的使用显微镜的使用二、对光二、对光3转
2、动转换器,使低倍物转动转换器,使低倍物镜对准通光孔镜对准通光孔(物镜的前端物镜的前端与载物台要保持与载物台要保持5厘米的距厘米的距离离)。显微镜的使用显微镜的使用显微镜的使用显微镜的使用三、观察三、观察 5 5把所要观察的玻片把所要观察的玻片标本放在标本放在 载物台上,用载物台上,用压片夹压住,标本要正压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。对通光孔的中心。6 6转动粗准焦螺旋,使转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止(眼接近玻片标本为止(眼 睛看着物镜,以免物镜碰睛看着物镜,以免物镜碰到玻片标本)。到玻片标本)。7 7向目镜内看,同时反向目镜内看,同时反方
3、向转动粗准焦螺旋,使方向转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清镜筒缓缓上升,直到看清物像为止。再略微转动细物像为止。再略微转动细准焦螺旋,使看到的物像准焦螺旋,使看到的物像更加清晰。更加清晰。显微镜的使用显微镜的使用8、换高倍物镜:、换高倍物镜:如果进一步使用高倍物镜观察,应如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分把物像中需要放大观察的部分移至视野中央移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。视野中的物像范围缩小了很多)。如果换高倍物镜后如果换高倍物镜后物像不一定很清晰
4、,可以转动细准焦螺旋进行调节物像不一定很清晰,可以转动细准焦螺旋进行调节。在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调节光圈或聚光器,使光线符合要求(一般将低倍物镜节光圈或聚光器,使光线符合要求(一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要调节光线强弱)。调节光线强弱)。1.1.转动反光镜使视野明亮转动反光镜使视野明亮2.2.在低倍镜下观察清楚后,把要在低倍镜下观察清楚后,把要放大观察的物像移至视野中央放大观察的物像移至视野中央3.3.转动转换器,换成高倍物镜转动转换器,换成高倍物镜4
5、.4.观察并用细准焦螺旋调焦观察并用细准焦螺旋调焦高倍镜的使用高倍镜的使用取镜和安放对光(选择低倍镜、反光镜、光圈)固定装片转动粗准焦螺旋,镜筒缓缓下降(目视物镜与装片之间)反向转动粗准焦螺旋,镜筒上升,直至看到物像移动目标至视野中央更換高倍物镜转动细准焦螺旋至标本影像清晰为止调节反光镜、光圈光学显微镜光学显微镜载物台上升载物台下降3.使用显微镜的注意事项使用显微镜的注意事项 (1)显微镜安放位置,)显微镜安放位置,显微镜应安放在离桌边缘显微镜应安放在离桌边缘5 cm、镜筒向前,、镜筒向前,并讲清显微镜位置稍靠左侧的道理(两眼同时并讲清显微镜位置稍靠左侧的道理(两眼同时睁开观察,眼不易疲劳,便
6、于绘图。)睁开观察,眼不易疲劳,便于绘图。)(2)对光根据光线的强弱来选择平面镜或凹对光根据光线的强弱来选择平面镜或凹面镜;用低倍镜进行对光,把低倍镜位置放低;面镜;用低倍镜进行对光,把低倍镜位置放低;在转动转换器时,物镜到位,光圈调节好,在转动转换器时,物镜到位,光圈调节好,视视野光线均匀、明亮野光线均匀、明亮.(3)正确使用高倍物镜的方法)正确使用高倍物镜的方法 由于高倍物镜的工作距离小,镜头易损坏,由于高倍物镜的工作距离小,镜头易损坏,,并且把光圈开大。并且把光圈开大。(4)重视准焦螺旋的使用)重视准焦螺旋的使用 在使用高倍物镜时,不要调节粗准焦螺旋,在使用高倍物镜时,不要调节粗准焦螺旋
7、,避免物镜损坏、装片压烂。避免物镜损坏、装片压烂。(5)不是倍数越大,越清晰)不是倍数越大,越清晰 如果目镜倍数过大,得到的放大虚像则很不如果目镜倍数过大,得到的放大虚像则很不清晰。在低倍镜下能看清楚的物像,不必用高清晰。在低倍镜下能看清楚的物像,不必用高倍镜观察。倍镜观察。3.使用显微镜的注意事项使用显微镜的注意事项视野中物像与标本移动的关系:视野中物像与标本移动的关系:如视野中某观察对象位于左下方如如视野中某观察对象位于左下方如何移到中央,应将装片或切片向左何移到中央,应将装片或切片向左下方移动(下方移动(同向移动同向移动)。原因是视)。原因是视野中物像移动的方向或切片移动的野中物像移动的
8、方向或切片移动的方向相反方向相反 使用高倍镜观察的步骤和要点是:使用高倍镜观察的步骤和要点是:(1)首先用低倍镜观察,找到要观察的物)首先用低倍镜观察,找到要观察的物像,移到视野的中央。像,移到视野的中央。(2)转动转换器,用高倍镜观察,并轻轻)转动转换器,用高倍镜观察,并轻轻转动细准焦螺旋,直到看清楚材料为止。转动细准焦螺旋,直到看清楚材料为止。高倍显微镜的使用高倍显微镜的使用(1)是低倍镜还是高倍镜的视野大,视野明亮?为什么?)是低倍镜还是高倍镜的视野大,视野明亮?为什么?低倍镜的视野大,通过的光多,放大的倍数小;低倍镜的视野大,通过的光多,放大的倍数小;高倍镜的视野小,通过的光少,但放大
9、的倍数高。高倍镜的视野小,通过的光少,但放大的倍数高。(2)为什么要先用低倍镜观察清楚后,把要放大观察的)为什么要先用低倍镜观察清楚后,把要放大观察的物像移至视野的中央,再换高倍镜观察物像移至视野的中央,再换高倍镜观察?如果直接用高倍镜观察,往往由于观察的对象不在如果直接用高倍镜观察,往往由于观察的对象不在视野范围内而找不到。视野范围内而找不到。因此,需要先用低倍镜观察清楚,并把要放大观察因此,需要先用低倍镜观察清楚,并把要放大观察的物像移至视野的中央,再换高倍镜观察。的物像移至视野的中央,再换高倍镜观察。(3)用转换器转过高倍镜后,转动粗准焦螺旋行不行?)用转换器转过高倍镜后,转动粗准焦螺旋
10、行不行?不行。用高倍镜观察,只需微调即可。不行。用高倍镜观察,只需微调即可。转动粗准焦螺旋,容易压坏玻片。转动粗准焦螺旋,容易压坏玻片。污点判断:污点判断:玻片移,污点移,则污点在玻片上;玻片移,污点移,则污点在玻片上;物镜换,污点移,则污点在物镜上;物镜换,污点移,则污点在物镜上;目镜转,污点移,则污点在目镜上目镜转,污点移,则污点在目镜上 目镜目镜5X5X、物镜、物镜4X4X、视野中央有一排细、视野中央有一排细胞共胞共15 15个。若把物镜换成个。若把物镜换成10X10X,则细胞,则细胞数目为(数目为()个。)个。因为视野中的细胞因为视野中的细胞数目与放大倍数成反比数目与放大倍数成反比;若
11、目镜;若目镜5X5X,物镜物镜4X4X,视野中共有,视野中共有5050个细胞,再把个细胞,再把物镜换成物镜换成10X10X,则视野中有(,则视野中有()个)个细胞。细胞。因为视野中看到的实物的范围因为视野中看到的实物的范围与放大倍数的平方成反比与放大倍数的平方成反比。练习:练习:洋葱鳞叶表皮细胞(1010)洋葱鳞叶表皮细胞(1040)洋葱鳞叶表皮细胞(1040)洋葱鳞叶表皮细胞装片(10 40)细胞壁细胞壁细胞核细胞核细胞质细胞质(液泡液泡)实验二实验二 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌 实验目的实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。2.掌握培养
12、基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。3.掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。实验原理实验原理 培养基是用人工的办法将多种营养物培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素素外外还应具有适宜的酸碱度还应具有适宜的酸碱度pH值值、缓、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。冲能力、氧化还原电位和渗透压。实
13、验器材实验器材(1)药品和试剂:牛肉膏、蛋白陈、药品和试剂:牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、溶液、l0盐酸溶液、琼脂、水盐酸溶液、琼脂、水(2)器材:小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、器材:小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试纸、试管、分装漏斗、棉花。试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、高压蒸气灭菌锅、烘箱。烘箱。实验步骤实验步骤 一、玻璃器皿的洗涤和包装一、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿:如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿:如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等包装培
14、养皿和移液管等。2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前的包装二、培养基的配制二、培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制(一)(一)培养基配方:培养基配方:牛肉膏牛肉膏2.5g 蛋白胨蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂、琼脂10.0g、自来水、自来水500mL、pH7.27.4。(二)(二)操作步骤:操作步骤:1.取一个取一个1000mL烧杯,装烧杯,装500mL蒸馏水。蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成分,依次加入水中溶按配方逐一正确称取各种成分,依次加入水中溶解。解。注意:注意:a.前一种成分溶解之后,才能加入下一种成分前一种成分溶解之后,才能加入下一种成分 b.蛋
15、白胨、肉膏可加热促进溶解蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c.加热过程应不断搅拌,以免糊底烧焦,并适当补充加热过程应不断搅拌,以免糊底烧焦,并适当补充因蒸发而损失的水量。因蒸发而损失的水量。3.调调pH值值:用:用10 NaOH调调pH至至7.27.4,用精密,用精密pH试纸对试纸对照。照。4.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁层纱布趁热过滤,以利结果的观察。但是供一般使用的培养基,该步可热过滤,以利结果的观察。但是供一般使用的培养基,该步可省略。省略。5.分装分装:将培养基分装于:将培养基分装于5支试管,其余全部倒入支试管,其余全部倒入
16、250mL锥形锥形瓶中,分别塞上棉塞。瓶中,分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染或瓶口上面造成污染(见图见图23)。分装量:固体培养基约为试。分装量:固体培养基约为试管高度的管高度的15,灭菌后制成斜面(图,灭菌后制成斜面(图24)。分装入锥形瓶内)。分装入锥形瓶内以不超过其容积的以不超过其容积的3/53/5为宜。半固体培养基以试管高度的为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为为宜灭菌后垂直待凝。宜灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口注意不要污染棉塞和瓶口。6.包扎成捆包扎成捆,挂上标签,注明何种培养基。,挂上标签,注明何种培养基
17、。7.灭菌备用灭菌备用:灭菌条件:灭菌条件:1210C(相当蒸汽压力(相当蒸汽压力0.103MPa)培)培养基灭菌后必须在养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h,确定无菌生长,方可,确定无菌生长,方可使用。使用。图 例图23培养基分装 图24 斜面制作 三、稀释水的制备三、稀释水的制备 1.取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸蒸馏水,放馏水,放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内,塞棉塞、包于锥形瓶内,塞棉塞、包扎,待灭菌。扎,待灭菌。2.另取另取5支支18mm180mm的试管,分别装的试管,分别
18、装9mL蒸馏水,塞棉塞、包扎,待灭菌。蒸馏水,塞棉塞、包扎,待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。四、灭菌四、灭菌 加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌法:电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法:电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a.将待灭菌的物品放入恒温箱,将温度调将待灭菌的物品放入恒温箱,将温度调节至节至160并维持并维持2h;b.把恒温箱的调节旋钮调回零处,待温度把恒温箱的调节旋钮调回零处,待温度降到降到50左右,才能将物品取出。左右,才能将物品取出。湿热灭菌:高压蒸气灭菌法湿热灭菌
19、:高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下:高压蒸气灭菌法的操作步骤如下:1.灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。2.将待灭菌的物品放入锅内,并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内,并关严锅盖。注意:器物不能装得太满。注意:器物不能装得太满。3.接通电源,进行加热。接通电源,进行加热。4.排除高压锅内的冷空气,可将排气阀打开,待排除高压锅内的冷空气,可将排气阀打开,待温度计指示温度为温度计指示温度为100时关闭排气阀;或当排时关闭排气阀;或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。5.当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭
20、菌器内的温度为121)即开始灭菌即开始灭菌,使其维持,使其维持1530min。对。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时,应适当降低压力质时,应适当降低压力(0.56kg/cm2),延长时,延长时间。间。6.灭菌时间一到,切断电源,灭菌时间一到,切断电源,待压力降至零时待压力降至零时,才能打开排气阀,然后打开灭菌器盖,取出物才能打开排气阀,然后打开灭菌器盖,取出物品,排出锅内剩余水。品,排出锅内剩余水。7.待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h,若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存
21、备用。间歇灭菌法:间歇灭菌法:即常压灭菌,用于一些受高温而破坏的培养基的灭即常压灭菌,用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。菌。操作方法:操作方法:a.待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里,每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里,每天蒸煮1次,每次在次,每次在100煮沸煮沸3060min,连续,连续3d重复进重复进行。行。b.在每两次蒸煮之间,将物品(指培养基)放在在每两次蒸煮之间,将物品(指培养基)放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h,这样可以使每次蒸煮后,这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体,以便下次蒸煮时未杀死残留的芽孢萌发成营养体,以便下次蒸煮时杀灭。杀灭。c.第三次蒸煮之后
22、基本无菌,但为了确保无菌仍要第三次蒸煮之后基本无菌,但为了确保无菌仍要放在放在 37恒温条件下培养恒温条件下培养24h,确定无菌才能使用。,确定无菌才能使用。过滤除菌法:过滤除菌法:不能用加热灭菌的液体物质(如维生素、血清),一般可用不能用加热灭菌的液体物质(如维生素、血清),一般可用细菌过滤器进行除菌。细菌过滤器进行除菌。用于除菌的滤器:a.蔡氏滤器,b.注射器装置滤器思考题思考题 1.配制培养基有哪几个步骤配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意在操作过程中应注意些什么问题些什么问题?为什么为什么?2.培养基配制完成后,为什么必须立即灭菌培养基配制完成后,为什么必须立即灭菌?若不若不能及
23、时灭菌应如何处理?已灭菌的培能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培 养基进行无菌检查?养基进行无菌检查?3.3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净,为什么高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净,为什么在灭菌后不能骤然快速降压,并要再放尽锅内蒸在灭菌后不能骤然快速降压,并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖汽才能打开锅盖?实验三实验三 细细菌纯种分离、培养和接菌纯种分离、培养和接种技术种技术实验目的实验目的 1.掌握从环境(土壤、水体、活性污泥、垃掌握从环境(土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等)中分离培养细菌的方法,从圾、堆肥等)中分离培养细菌的方法,从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。2.
24、掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。实实 验验 器器 材材 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移套、无菌移液管液管1mL2支、支、10mL1支。支。营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶,活性污泥或土壤或瓶,活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶,无菌稀释水瓶,无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。其它:接种环、酒精灯、恒温箱。其它:接种环、酒精灯、恒温箱。实实 验验 步步 骤骤一、细菌的纯种分离一、细菌的纯种分离 (一一)稀释平板法稀释平板法 1.取样取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水,迅速带回实验室。用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水,迅速带回实验室。2.稀释水样稀释水样 将将1
25、瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好,用记号笔依次编上无菌水排列好,用记号笔依次编上101、102、103、104、105、106。在无菌操作条。在无菌操作条件下,用件下,用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中,将移液管吹洗三中,将移液管吹洗三次,用手摇次,用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌浓度的菌液。用液。用1mL无菌移液管吸取无菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号浓度的菌液于编号为为102无菌水中,将移液管吹洗三次,摇匀即为无菌水中,
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