微生物与基因工程课件-2.ppt

1、第十章第十章 微生物与基因微生物与基因工程工程 基因工程基因工程(genetic engineering)或重组或重组DNA技术技术(combinant DNA technology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。者令生物表现出新的性状。克隆克隆(clone):无性繁殖系的意思。无性繁殖系的意思。一、基因工程的发展历史一、基因工程的发展

2、历史18651865 G.J.Mendel G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验186618661944 1944 O.T.AveryO.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验19721972 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNADNA分子分子197319731977 1977 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗遗传传19741974 工程公司工程公司,专门应用重组专门应用重组DNADNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物药物197519751980 1980 开始建

3、造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNADNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂197619761997 1997 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉第一节第一节 基因工程概述基因工程概述 二二、基因工程的基本过程基因工程的基本过程 1.1.分离或合成基因；分离或合成基因；2.2.通过体外重组将基因插入载体；通过体外重组将基因插入载体；3.3.将重组将重组DNADNA导入细胞；导入细胞；4.4.扩增克隆的基因；扩增克隆的基因；5.5.筛选重组体克隆；筛选重组体克隆；6.6.对克隆的基因进行鉴定或测序；对克隆的基因进行鉴定或测序；7.7.控制外源基因的表达；控

4、制外源基因的表达；8.8.得到基因产物或转基得到基因产物或转基因动物、转基因植物因动物、转基因植物。1.1.将将目的基因目的基因与与运载运载体体DNADNA在体外进行重组在体外进行重组目的基因目的基因载体载体DNA限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶DNA 重组体重组体引入宿主细胞引入宿主细胞筛选含有重组体的细胞筛选含有重组体的细胞无性繁殖扩增、基因表达、纯化产物无性繁殖扩增、基因表达、纯化产物2.2.转化或转染转化或转染3.3.筛选筛选4.4.克隆（克隆（cloningcloning）表达表达1、获取TTTTAAAA质粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATT DN

5、A重组基本过程重组基本过程2、重组TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT3、转化转化到宿主细胞中(如E.coli)宿主细胞染色体DNA重组质粒重组质粒4、筛选筛选含有重组质粒的菌株宿主细胞染色体DNA重组质粒含有外源DNA的“工程菌”5、克隆含有外源DNA的“工程菌”繁殖/扩增6、表达表 达 产 物 分 离 纯 化表达产物分离纯化表达产物分离纯化2.2.克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；3.3.工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化的；工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化的；4.4.微生物细胞是基因克隆的宿主；微生物

6、细胞是基因克隆的宿主；5.5.大多数基因产品都是通过微生物发酵生产；大多数基因产品都是通过微生物发酵生产；1.1.微生物的多样性为基因工程提供了极其丰富而独特微生物的多样性为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；的基因资源；6.6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生物的研究。对微生物的研究。第二节第二节 基因的分离、合成和定位诱变基因的分离、合成和定位诱变一一.从基因文库或从基因文库或cDNAcDNA文库中分离目的基因文库中分离目的基因1.1.从基因文库中分离目的基因从基因文库中分离目的基因 1 1）基因组文库的构建）基因组文库的构建

7、基因组文库就是指基因组DNA片段的全部克隆。即将整个基因组用合适的限制性酶切成合适长度的片段，并用一种载体将全部片段进行克隆，文库中每一个克隆只含基因组某一特定的DNA片段。制备基因组制备基因组DNADNA文库文库分离、纯化基因组分离、纯化基因组DNADNA 条件：条件：温和，在温和，在EDTAEDTA或或SDSSDS等存在下等存在下 限制酶部分消化限制酶部分消化 用蛋白酶用蛋白酶K K消化细胞、酚抽提消化细胞、酚抽提大小不同大小不同DNADNA酶切片段酶切片段 片段分离：片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离常用蔗糖梯度或电泳分离 分别与同样分别与同样RERE消化的载体连接消化的载体连接 常用噬菌

8、体载体或质粒载体常用噬菌体载体或质粒载体 DNA DNA连接酶连接。连接酶连接。导入细胞导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。进入宿主细胞内培养扩增。筛选鉴定筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。理想的基因组文库应包含该生物基因组全部理想的基因组文库应包含该生物基因组全部遗传信息。遗传信息。通常基因组越大需要的克隆数越多，要求库通常基因组越大需要的克隆数越多，要求库容量也越大。容量也越大。基因组文库的大小的估算：基因组文库的大小的估算：N=ln（1P）/ln（1 f）N：为基因组文库必需的克隆数目。为基因组文库必需的克隆数目。P：为文库中含目的基因为文库中含目的

9、基因DNA片段的出现概率。片段的出现概率。f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。是插入片段的大小与全基因组大小的比值。DNA 文 库2.2.从从cDNAcDNA文库中分离目的基因文库中分离目的基因 cDNA文库是指生物文库是指生物mRNA的全部的全部cDNA克克隆。文库中每个克隆只含一种隆。文库中每个克隆只含一种mRNA信息信息制备制备cDNA文库文库（1）由）由mRNA合成合成cDNA第一条链第一条链（2）合成）合成cDNA第二条链第二条链（3）构建）构建cDNA文库文库 分离目的基因分离目的基因 的的mRNAmRNA逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA单链单链 水解去除水解去除mRNA

10、mRNA，合成合成cDNAcDNA双链双链 水解回折处单链水解回折处单链得到平端双链得到平端双链cDNAcDNA导入宿主细胞克隆导入宿主细胞克隆,构建构建cDNAcDNA文库文库3 从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 根据目的基因序列，设计制备并标记根据目的基因序列，设计制备并标记特异探针与特异探针与DNADNA杂交或杂交或PCRPCR方法，可从文库方法，可从文库中筛选出目的基因。中筛选出目的基因。用用DNADNA测序仪测出某一基因的碱基序列，测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用序列，再用DNADNA

11、合成仪通过化学合成原理合成合成仪通过化学合成原理合成目的基因。目的基因。一般先合成短片断一般先合成短片断DNADNA，然后再拼接成长，然后再拼接成长片段。片段。二、二、基因的化学合成基因的化学合成三三 PCR PCR 扩增基因扩增基因PCR扩增仪 1984，穆利斯（Mullis）发明了聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。1.PCR扩增原理扩增原理 引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。如果DNA片段两端的序列片段两端的序列是已知的，可采用PCR将此DNA片段扩增出来。PCR过程需

12、要合成两个寡聚核苷酸两个寡聚核苷酸作引物，并各自与所要扩增的靶DNA片段的末端互补。PCR扩增分三步扩增分三步 (1)变性变性(denaturation)加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。9296 (2)退火退火(annealing)温度下降，寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。4060 (3)延伸延伸(extension)在适宜条件下，引物3端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。6572 DNA片断呈片断呈2的指数增长，的指数增长，12h重复重复2030次循环，次循环，DNA扩增至扩增至106107。PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环-

13、变性PCR循环退火PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸 2.来自微生物的耐高温来自微生物的耐高温DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶聚合酶：1988，从水生栖热菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离，在95温度下保持稳定稳定，在高温下以单链DNA为模板合成互补链，一次加酶可满足PCR全过程需求。缺乏校正功能。缺乏校正功能。PfuDNA聚合酶和聚合酶和Vent DNA聚合酶聚合酶：是一类既耐热又具校正功能的酶，提供了PCR产物的特异性。Pfu是从火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离的。VentDNA聚合酶从极端耐热菌中分离的。聚合酶从极

14、端耐热菌中分离的。Tth DNA聚合酶：聚合酶：同时具有逆转录酶活性。可使RT-PCR在同一体系中进行，先将RNA逆转录成DNA，作为PCR的模板，再进行PCR。从嗜热菌中分离 3.PCR技术的应用技术的应用 （1）可用于DNA的扩增和克隆：制备单链或双链DNA探针；基因拼接、定位诱变和DNA测序；转基因动、植物。（2）在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。（3）用于法医，以鉴别个体和判定亲缘关系。（4）动、植物检疫。四四.基因的定位诱变（基因的定位诱变（site-directed mutagenesis）使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或

15、缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。1)1)寡核苷酸指导的定位诱变寡核苷酸指导的定位诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。祥见祥见p2722)盒式诱变盒式诱变(cassette mutagenesis)3）PCR定点诱变定点诱变一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)第三节微生物与基因工程工具酶第三节微生物与基因工程工具酶 简称限制性酶限制性酶(restriction enzyme)是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点

16、或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。限制酶分为限制酶分为、III三种类型三种类型，通常所说的限制性核酸内切酶，即指即指型型限制酶限制酶。1.1.命名命名 EcoRI E：大肠杆菌属名第一个字母；co：种名头两个字母；R：株名；I：该菌中第一个被分离出来的酶。副溶血嗜血杆菌的酶表示为Hph I (Haemophilus parahaemolyticus)副流感嗜血杆菌的酶表示为Hpa I (Haemophilus parainfluenzae)属名相同，种名头四个字母相同，第三个字母用属名相同，种名头四个字母相同，第三个字母用种名后的

17、另一个字母代替。种名后的另一个字母代替。2.2.限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列通常由48个碱基对个碱基对组成，具有二重具有二重旋转对称轴，呈回文结构旋转对称轴，呈回文结构。回文结构是指回文结构是指双链DNA中含有二个结构相同、方向相反的序列也称为反向重复序列。例如：例如：5-GGTACC-3 5-GGTACC-3 3-CCATGG-5 3-CCATGG-5 赏花归去马如飞，赏花归去马如飞，去马如飞酒力微；去马如飞酒力微；酒力微醒时已暮，酒力微醒时已暮，醒时已暮赏花归醒时已暮赏花归。暮暮 已赏已赏 时花时花 醒归醒归 微去微去 力马力马 酒如酒如 飞飞回文诗回文诗

18、 所有限制酶切割所有限制酶切割DNA后，均产生含后，均产生含5磷酸基和磷酸基和3羟基的末端。羟基的末端。(1)(1)形成粘性末端形成粘性末端（2 2）形成平末端）形成平末端-G-CTTAA53AATTC-G-35-G-CTTAA53AATTC-G-35+EcoR I平端切口平端切口粘端切口粘端切口基因组不同长基因组不同长度的酶切片段度的酶切片段可用凝胶电泳可用凝胶电泳区分开区分开 二、二、DNA连接酶连接酶 催化两个双链DNA片段相邻的5磷酸与3羟基之间形成磷酸二酯键。T4DNA连接酶连接酶：通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶：连接酶：不能催化

19、DNA分子的平端连接。第四节第四节 微生物与克隆载体微生物与克隆载体 克隆载体的基本要求克隆载体的基本要求：能够进行独立自主地复制；能够进行独立自主地复制；含有多克隆位点，即具有若干限制酶的单一切含有多克隆位点，即具有若干限制酶的单一切点，便于外源基因的插入；点，便于外源基因的插入；具有可供选择的遗传标记。具有可供选择的遗传标记。克隆载体克隆载体(cloning vector)：负责将外源基因送入宿主细胞并进行复制与 扩增的运载工具。具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外不自由扩散。在胞外不自由扩散。一、质粒载体一、质粒载体（1）环状双链的D

20、NA分子，由4361bp组成；（2）可插入小于5 5kbkb左右左右的外源DNA；（3）是松弛型质粒，在细胞中有较高的拷贝数；pBR322pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒载体。是基因工程中最常用和最具代表性的质粒载体。（4）具有四环素四环素(TetTetr r)和和氨苄青霉素氨苄青霉素(AmpAmpr r)两种抗性基因；（5）有2424种限制酶的单一切点种限制酶的单一切点，其中7种位于四环素抗性基因之内，3种位于氨卡青霉素抗性基因之内。氨苄青氨苄青霉素霉素抗抗性基因性基因四环素四环素抗性基抗性基因因 二、二、噬菌体载体噬菌体载体 （1 1）噬菌体载体噬菌体载体优点优点 寄主大肠

21、杆菌；线状双链DNA，大小约50kb DNA两端有12个核苷酸互补，形成粘性末端（cos位点），进入寄主后形成环状双链DNA。分子遗传学背景十分清楚；容量较大，能容纳大约容量较大，能容纳大约23kb的外源的外源DNA片段；片段；具有较高的感染效率，几乎可达100%（质粒转化率只有0.1%）。插入外源插入外源DNADNA的长度受到一定限制，因的长度受到一定限制，因为噬菌体头部容纳为噬菌体头部容纳DNADNA的量是一定的，否则的量是一定的，否则不能正常装配。不能正常装配。（2 2）噬菌体载体缺点噬菌体载体缺点 具有克隆大片段外源DNA的能力。柯斯质粒本身一般只有柯斯质粒本身一般只有57kb左右，而

22、它克隆外源左右，而它克隆外源DNA片段可达片段可达35-45kb。常用于构建基因文库。常用于构建基因文库。优点：优点：具有噬菌体的高效感染力，在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体，仅以质粒形式存在；三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体(cosmid vector)即黏粒载体即黏粒载体，由由噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端cos位点和质粒位点和质粒构建而成。构建而成。四、四、M13M13噬菌体载体噬菌体载体 突突出优点是用于制备测序用的单链出优点是用于制备测序用的单链DNADNA、单链、单链DNADNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。1.M13是大肠杆菌丝

23、状噬菌体丝状噬菌体，其基因组为环状环状ssDNA，大小为6407bp，只感染雄性大肠杆菌（只感染雄性大肠杆菌（F+或或Hfr），通过性纤毛进入宿主细胞成为复制型），通过性纤毛进入宿主细胞成为复制型dsDNA，滚环复制产生ssDNA；2.M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段；五、噬菌粒载体五、噬菌粒载体 噬菌粒噬菌粒(phagemidphagemid)是由M13M13噬菌体和质粒噬菌体和质粒DNADNA融合融合而成,含有M13的复制起点和质粒的复制起点、选择标记和多克隆位点。优点：优点：载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作；可克隆l0kb外源D

24、NA片段，克隆能力比M13大；可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。六、真核生物的克隆载体六、真核生物的克隆载体 1.1.酵母质粒载体酵母质粒载体 酵母质粒载体都是利用酵母的2m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的。能分别在细菌和酵母菌中复制属于穿梭质粒。穿梭质粒。2.Ti 2.Ti 质粒载体质粒载体 Ti质粒是植物基因工程的理想载体，根癌农杆菌含有的Ti质粒，大小约200kb。当它感染植物时，Ti质粒中的T-DNA 区段可转移并整合到植物细胞的基因组DNA中。3.3.真核生物病毒载体真核生物病毒载体 哺乳动物病毒（SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒），昆虫，植物病毒，经改造后都

25、可作为基因载体。七、人工染色体七、人工染色体 1.酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）为了研究真核生物基因组的结构，需要克隆较大的DNA 片段，一般的质粒和病毒载体不能达到要求，利用染色体DNA 的结构构建了人工染色体，可携带较大DNA片段。酵母人工染色体酵母人工染色体是目前能容纳最大外源 DNA 片段的人工构建载体。YAC含有构成酵母染色体的3个必要单元：着丝粒（着丝粒（centromerecentromere,CEN,CEN），保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞；端粒（端粒（telomere,TEL telomere,T

26、EL），），位于染色体两个末端，防止染色体 DNA 复制过程中两端序列的丢失，保证DNA正常复制；酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（autonomously autonomously replicating sequence,ARS replicating sequence,ARS）其功能与酵母细胞复制有关此外还有限制酶切位点和选择标记基因。YAC 克隆外源克隆外源 DNA 能力非常大，一个能力非常大，一个 YAC 可插入长达可插入长达 106 碱基以上碱基以上 DNA 片段片段。因。因此此 YAC 既保证所插入外源基因结构的完整性，既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克

27、隆的数目。目前又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前 YAC 已成为构建高等真核生物基因库的重要载已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。n 能携带约能携带约300kb300kb大片段大片段DNADNA。2.细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）以F因子为基本骨架构建。主要用于基因组文库构建、大基因簇研究和各类基因组计划中。八、外源基因与载体体外连接八、外源基因与载体体外连接（主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式）1)1)黏性末端连接黏性末端连接效率高效率高 2 2）人工接头法）人工接头法 3 3）均聚

28、物加尾法）均聚物加尾法 4 4）平头末端连接平头末端连接一、克隆宿主的基本要求一、克隆宿主的基本要求能够高效吸收外源能够高效吸收外源DNA；不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源未经修饰的外源DNA发生降解；发生降解；一般为重组缺陷型一般为重组缺陷型(RecA-)菌株，使克隆载体菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；之间不发生同源重组；具有使外源具有使外源DNA进行高效复制的酶系统进行高效复制的酶系统便于进行基因操作和筛选；便于进行基因操作和筛选；具有安全性具有安全性:宿主细胞应该对人、畜、农作物无害

29、宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。或无致病性等。第五节第五节 外源基因导入寄主细胞外源基因导入寄主细胞大肠杆菌作为宿主的优缺点大肠杆菌作为宿主的优缺点 优点优点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等。缺点：缺点：条件致病菌和产生内毒素。一些诱变的大肠杆菌已解决了以上大部分问题。1.1.原核生物宿主原核生物宿主 大肠杆菌大肠杆菌和枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 2.2.真核生物宿主真核生物宿主 酿酒酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞。1、外源基因导入原核细胞、外源基因导入原核细胞1.1.转化：转化：在原核生物中，通过将外源在原核生物中，通过将外源DNAD

30、NA导入受体导入受体细胞，从而获得新的遗传物质的方法。如氯化细胞，从而获得新的遗传物质的方法。如氯化钙法。钙法。二二 外源基因导入寄主细胞的方式外源基因导入寄主细胞的方式2.2.转导转导:以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNADNA片段携带到受体细胞中，通过交换与片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性整合，从而使后者获得前者部分遗传性状状.1 1）酵母）酵母 (1)(1)原生质体法原生质体法 (2)(2)离子溶液法离子溶液法 (3)(3)电穿孔法电穿孔法 (4)PEG1000(4)PEG1000法法2.2.外源外源DNADNA导入真核

31、细胞导入真核细胞 2）外源基因导入动物细胞：）外源基因导入动物细胞：磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法DEAE-DEAE-葡聚糖法葡聚糖法电穿孔法电穿孔法脂质体法脂质体法动物病毒法动物病毒法显微注射法显微注射法3）外源基因导入植物细胞）外源基因导入植物细胞 农杆菌法：农杆菌法：TiTi质粒质粒即即tumor-inducing plasmidtumor-inducing plasmid基因枪法基因枪法：使用高能微粒子使用高能微粒子轰击将轰击将DNADNA导入细胞或活的导入细胞或活的组织内。亚微粒的钨和金组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附能自发地吸附DNADNA，将这些，将这些微弹加速到很高的速度轰微弹

32、加速到很高的速度轰击细胞击细胞 基因枪电转仪电转仪电转化电转化 三、目的克隆的筛选和鉴定三、目的克隆的筛选和鉴定1.1.载体上选择标记的鉴定载体上选择标记的鉴定 从众多克隆中从众多克隆中筛选和鉴定含有目的基因的重组体筛选和鉴定含有目的基因的重组体克隆，克隆，通常有通常有3 3类鉴定方法：类鉴定方法：1 1）抗生素平板法）抗生素平板法 因为自身环化的载体和为被酶解的载体的转化细因为自身环化的载体和为被酶解的载体的转化细胞，在抗生素平板上也能生长，所以假阳性率较高。胞，在抗生素平板上也能生长，所以假阳性率较高。外源基因插入载体的位点位于载体抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有抗生素的平

33、板上，仍可长出菌落。外源DNA插入位点位于载体的抗生素抗性基因之内，转化后的重组体在含该抗生素的平板上不能够生长。2 2）插入失活法插入失活法 含有不带外源基因含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，可的质粒的宿主细胞，可以在含有四环素或氨苄以在含有四环素或氨苄青霉素平板上生长，青霉素平板上生长，3 3）-半乳糖苷酶显色反应法半乳糖苷酶显色反应法-互补互补(蓝白筛选蓝白筛选)某些载体，如某些载体，如M13噬菌体、噬菌体、pUC和和pGEM等质粒，等质粒，携带携带lacZ 基因的一段序列基因的一段序列编码编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽肽，而受体细胞为，而受体细胞为lacZ 基因突变株，无基因突变株，

34、无-半乳糖苷半乳糖苷酶活性，但遇酶活性，但遇肽，可肽，可发生发生互补作用，产生具有活互补作用，产生具有活性的酶性的酶，使培养基中的无色物质使培养基中的无色物质X-gal 分解成半乳糖分解成半乳糖和蓝色的和蓝色的5-溴溴-4氯靛蓝，使菌落呈蓝色氯靛蓝，使菌落呈蓝色；外源基因插外源基因插入位点在载体的入位点在载体的lacZ 基因内，失去基因内，失去互补作用，结互补作用，结果带有外源基因的菌落呈白色。果带有外源基因的菌落呈白色。大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，但利用乳糖的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会合成。大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因:Z、Y和A。它们被同一个转录单元lacZYA编码，共有一个启

35、动子。lacZ 编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，将乳糖水解为半乳糖和葡，将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖萄糖。lacY 编码编码半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶，将乳糖运送透过细菌的，将乳糖运送透过细菌的细胞壁。细胞壁。lacA 编码编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶硫代半乳糖苷乙酰转移酶。大肠杆菌乳糖操纵子的结构特点大肠杆菌乳糖操纵子的结构特点IPOZYA控制位点控制位点阻遏蛋白阻遏蛋白启动序列启动序列操纵序列操纵序列半乳糖苷酶半乳糖苷酶通透酶通透酶RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主：编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列

36、 -互补互补细菌表达：细菌表达：-半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（X-gal）形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。（IPTG 存在下）存在下）2.目的基因序列的鉴定目的基因序列的鉴定1）菌落（活噬菌斑）原位杂交（）菌落（活噬菌斑）原位杂交（in situ hybridization)为进一步确定目的基因克隆，可利用与目的基因互补的DNA或RNA序列制备核酸探

37、针与菌落或噬菌斑进行原位杂交。大致步骤如下：转化细胞形成菌落或噬菌斑 将硝酸纤维素膜贴在平板上使菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，翻转置另一平板上，长出菌落或用噬菌斑后，用碱性裂解液处理使菌体裂解释放DNA并使DNA变性 经烘烤使其固定在膜上 用经标记的探针进行分子杂交筛选阳性克隆。此方法可在短时间内从成千上万的克隆中快速筛此方法可在短时间内从成千上万的克隆中快速筛选到阳性克隆选到阳性克隆.原原位位杂杂交交2)内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定 培养筛选的阳性克隆 提取质粒或重组噬菌体 1-2种内切酶酶切 凝胶电泳检测插入片段的大小。3)PCR鉴定鉴定 以插入片段两侧设计引物,以重组质粒为模板进行PCR扩增。4)DNA序列鉴定序列鉴定 为确定目的序列的正确性必须对重组体DNA进行测序分析。3.基因表达产物的鉴定基因表达产物的鉴定1）免疫活性测定）免疫活性测定 如果表达产物是蛋白质或肽并具有抗原性，可如果表达产物是蛋白质或肽并具有抗原性，可与其特异抗体发生免疫反应。与其特异抗体发生免疫反应。2）生物活性测定）生物活性测定 若表达产物是酶，可测定其酶活性若表达产物是酶，可测定其酶活性3）氨基酸序列测定）氨基酸序列测定 测定经部分水解的表达产物的肽谱或测定经部分水解的表达产物的肽谱或N端或端或C端端的氨基酸序列。的氨基酸序列。