基因工程大实验课件.ppt

1、实验实验 一、一、大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备实验实验 二、二、大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化实验实验 一、一、碱变性法抽提质粒碱变性法抽提质粒DNA实验实验 四、四、DNA的纯度、浓度及分子量的测定的纯度、浓度及分子量的测定实验实验 五、五、DNA的酶切、连接与转化的酶切、连接与转化实验实验 六、六、动物基因动物基因组组DNA的提取和检测的提取和检测实验实验 七、七、植物基因组植物基因组DNA的提取和检测的提取和检测实验实验 八、八、聚合酶链式反应实验聚合酶链式反应实验-随机扩增随机扩增 多态性多态性DNA分析分析实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及

2、原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂v仪器仪器 琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电 泳系统泳系统 凝胶成像系统凝胶成像系统 紫外紫外-可见分光光可见分光光 度计度计v材料材料 pUC18pUC18v试剂试剂 DNA MarkerDNA Marker TAE/TBE TAE/TBE缓冲液缓冲液 点样缓冲液点样缓冲液 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）琼脂糖琼脂糖实验结果实验结果v l ll l操作步骤操作步骤vDNADNA分子量测定分子量测定 （1 1）琼脂糖凝胶的制备）琼脂糖凝胶的制备 取取0.70.7g g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加琼脂糖，放

3、入锥形瓶中，加100100ml ml 0.5 0.5倍倍TBE/TAETBE/TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶缓冲液，置微波炉加热至完全溶 化，取出摇匀，则为化，取出摇匀，则为0.7%0.7%琼脂糖凝胶。待凝胶琼脂糖凝胶。待凝胶 冷却至冷却至60 60，加入，加入EBEB，使终浓度为使终浓度为0.50.5g/mlg/ml。（2 2）胶板的制备）胶板的制备 将有机玻璃内槽、梳子等洗净烘干。将有机玻璃内槽、梳子等洗净烘干。将有机玻璃放置于凝胶槽内，并放好梳子。将有机玻璃放置于凝胶槽内，并放好梳子。将将6060左右的琼脂糖凝胶液缓慢而连续地左右的琼脂糖凝胶液缓慢而连续地 倒入有机玻璃内槽，直至有机

4、玻璃板上形成一层倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层 均匀的胶板（注意：若有气泡产生，用小枪头吸均匀的胶板（注意：若有气泡产生，用小枪头吸出）。出）。待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅速待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅速 拔出），取有机玻璃内槽（带胶板），放在拔出），取有机玻璃内槽（带胶板），放在 电泳槽内。电泳槽内。加电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太加电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太 多或太少）。多或太少）。（3 3）加样）加样 用移液枪将样品用移液枪将样品DNADNA与上样缓冲液混匀。与上样缓冲液混匀。操作步骤操作步骤 将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面

5、以下，缓慢将液体加入（注意：加样后枪头离开以下，缓慢将液体加入（注意：加样后枪头离开 液面后再松开枪）。液面后再松开枪）。注意：记录点样顺序及点样量注意：记录点样顺序及点样量 （4 4）电泳）电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源（接通电泳槽与电泳仪的电源（DNADNA带负电）。带负电）。当溴酚蓝染料移动到距胶前沿当溴酚蓝染料移动到距胶前沿1212cmcm处，停处，停 止电泳止电泳。实验实验 八、聚合酶链式反应实验八、聚合酶链式反应实验 随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA分析分析实验目的实验目的学习掌握PCR反应的基本原理与实验技术学习掌握PCR仪的使用方法相关知识及原理相关知识及原理 聚合酶链

6、式反应（聚合酶链式反应（polymerasepolymerase chain chain reaction,PCRreaction,PCR）的原理类似于的原理类似于DNADNA的天然复的天然复 制过程。在待扩增的制过程。在待扩增的DNADNA片段两侧和与两侧片段两侧和与两侧 互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火 和延伸若干个循环后，和延伸若干个循环后，DNADNA扩增扩增2 2n n倍。倍。操作步骤操作步骤1 1、在、在0.20.2m L Eppendorfm L Eppendorf管内配置管内配置2020LL反应体系：反应体系：反应物反应物 体积体积/LL

7、 ddH ddH2 2O 1 2O 1 2 10 10 PCR PCR缓冲缓冲 2.02.0 2.5 2.5 mmolmmol/L/L dNTP dNTP 2.02.0 随机引物随机引物 1.01.0 模版模版DNA 2.0DNA 2.0 Taq Taq酶酶 1.0 1.0（1 1U U）点动混匀，加点动混匀，加10 10 LL矿物油。矿物油。操作步骤2 2、按下述程序进行扩增反应条件：、按下述程序进行扩增反应条件：（1 1）9494C C 预变性预变性 4 4minmin；（2 2）9494C C 变性变性 3030secsec；（3 3）3636C C 退火退火 4040secsec；（4

8、 4）7272C C 延伸延伸 100100s s；（5 5）重复步骤（重复步骤（2 2）（4 4）3535次；次；（6 6）7272C C 延伸延伸 7 7minmin。操作步骤操作步骤3 3、琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR结果配置结果配置1.4%1.4%琼琼 脂糖凝胶，取脂糖凝胶，取10 10 LL扩增产物电泳。扩增产物电泳。实验结果实验结果实验实验 六、动物基因组六、动物基因组DNADNA 的提取和检测的提取和检测实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的实验目的 学习掌握从动物组织提取基因组学习

9、掌握从动物组织提取基因组 DNA的原理和方法，以及相对分的原理和方法，以及相对分 子质量较大的子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶 电泳技术。电泳技术。相关知识及原理相关知识及原理 在在EDTAEDTA和和SDSSDS等去污剂存在下，用蛋等去污剂存在下，用蛋 白酶白酶K K消化细胞，随后用酚抽提，可以得消化细胞，随后用酚抽提，可以得 到哺乳动物基因组到哺乳动物基因组DNADNA，用此方法得到的用此方法得到的 DNADNA长度为长度为100100150150kbkb，适用于适用于噬菌体噬菌体 构建基因组文库和构建基因组文库和SouthernSouthern分析。分析。仪器、材料和试剂仪器、

10、材料和试剂仪器仪器 台式离心机台式离心机 玻璃匀浆器玻璃匀浆器 高压灭菌锅高压灭菌锅 恒温水浴器恒温水浴器材料材料 兔肝兔肝试剂试剂 蛋白酶蛋白酶K K 组织匀浆液组织匀浆液 酶解液酶解液 RNARNA酶酶 TETE溶液溶液实验结果实验结果提取的提取的DNADNA应为一条带应为一条带实验实验 七、植物基因组七、植物基因组DNADNA 的提取和检测的提取和检测实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的实验目的学习掌握从植物组织中提取DNA的 方法学习掌握液氮的使用相关知识及原理相关知识及原理 利用液氮对植物组织进行研磨破碎

11、利用液氮对植物组织进行研磨破碎 细胞。细胞提取液中含有的细胞。细胞提取液中含有的SDSSDS溶解膜蛋溶解膜蛋 白而破坏细胞膜，使蛋白变性而沉淀下白而破坏细胞膜，使蛋白变性而沉淀下 来。来。EDTAEDTA抑制抑制DNADNA酶的活性。再用酚、氯酶的活性。再用酚、氯 仿提取的方法去除蛋白，得到的仿提取的方法去除蛋白，得到的DNADNA溶液溶液 经乙醇沉淀。经乙醇沉淀。仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂仪器仪器 低温离心机低温离心机 恒温水浴器恒温水浴器 台式离心机台式离心机 琼脂糖凝胶系统琼脂糖凝胶系统材料材料 试剂试剂 CTABCTAB提取缓冲液提取缓冲液 TETE实验步骤实验步骤 CTABCT

12、AB提取法：提取法：（1 1）称取）称取0.50.5克植物材料放入预冷至克植物材料放入预冷至-20-20的研钵中的研钵中 （提前灭菌），加入少量石英沙，再倒入液氮（提前灭菌），加入少量石英沙，再倒入液氮 (分批加入分批加入)，研成粉末状，置于灭菌的，研成粉末状，置于灭菌的1010mlml离离 心管心管 中。中。（2 2）加入加入2 2ml 65ml 65预热的预热的CTABCTAB提取缓冲提取缓冲液液充分混匀充分混匀 后在后在6565保温保温9090minmin;实验步骤实验步骤 CTABCTAB提取缓冲液提取缓冲液:2%2%（w/vw/v）十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵（CTAB

13、CTAB）:1.4M NaCl 1.4M NaCl；20mM EDTApH8.020mM EDTApH8.0；100Mm 100Mm TrisTris-HCl HCl pH8.0 pH8.0；2%(2%(w/vw/v)聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）；）；5%5%（v/vv/v）巯基乙醇（使用前加入）巯基乙醇（使用前加入）（3）加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）充分摇 匀后，4 6000r/min离心15 min。实验步骤实验步骤（4）用扩口吸头取上清液移入另一10ml离心管中，加入2/3体积-20预冷的异丙醇，轻轻颠倒摇 匀后，-20放置20min,在冷冻离心机上于 4 500

14、0r/min离心10 min,缓慢倾倒出上清 液。（5）在沉淀中加入1ml65预热的CTAB提取缓冲液 ，温浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等体积氯 仿：异戊醇，充分混匀，4 6000r/min离心 10 min。实验步骤实验步骤（6）重复第4步；（7）用70%乙醇洗沉淀两次，在室温晾干，加入200l TE缓冲液溶解 DNA 2h。（8）配制0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析，取 5l的样品电泳。实验结果提取的DNA应为靠近点样孔的一条带，操作步骤操作步骤1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后 置于4ml匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明 显组织块存在（冰浴操作）。2、将组织细胞移至10ml离

15、心管中,4 4000 rpm离心1.5min,弃上清。3、沉淀加1ml无菌水迅速吹散，再加1ml酶解液，翻转混匀（动作一定要轻）55水浴处理12 18h。操作步骤操作步骤4、加RNase至终浓度100g/m（222l）,37水 浴2h。5、加入等体积酚(约2ml)抽提一次，（慢慢旋转 混匀，水平摇床摇10min），4 8000 rpm离 心10min。6、用扩口吸头移出含DNA的 水相（注意勿吸出 双相界面蛋白层），加等体积(约2ml)氯仿：异戊醇（24：1）4 10min,8000 rpm离心 10min。（有时如果DNA含量过高，水相在下 层，实验时注意观察）操作步骤操作步骤7、用扩口吸头

16、小心吸出上层含DNA的水相，移入 10ml离心管，加入250l 5mol/l NaCI(终浓 度0.1-0.25mol/l),小心混匀（要充分），在向每管中加入2.5倍体积(约6ml)的无水乙 醇-20 2h。8、12000rpm离心15min，弃上清，70%冷乙醇洗 涤一次，12000rpm离心15min，室温干燥，加入100l TE缓冲液，轻摇混匀，存放4 过夜（或2h）。9、电泳鉴定（0.7%的琼脂糖凝胶）。仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂仪器 PCR仪 琼脂糖凝胶电泳系统材料 兔基因组DNA 随机引物 试剂 PCR缓冲（10）dNTP Taq酶 矿物油实验五、实验五、DNADNA的酶切

17、、连接的酶切、连接 与转化与转化实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的实验目的v学习掌握重组学习掌握重组DNADNA连接以及鉴定重连接以及鉴定重组子的方法。组子的方法。v学习掌握学习掌握X-gal X-gal 等试剂的配制保存。等试剂的配制保存。v重组子重组子vT4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶催化连接酶催化DNADNA连接反应连接反应:（1 1）酶）酶 +ATP=ATP=酶酶-AMPAMP复合物复合物 （2 2）酶）酶-AMPAMP复合物结合复合物结合DNADNA切口上，使切口上，使 DNADNA腺苷化腺苷化

18、（3 3）形成新的磷酸二酯键，封闭切口）形成新的磷酸二酯键，封闭切口v蓝白斑选择蓝白斑选择（XgalXgal 、IPTG IPTG）、）、互补互补仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂v仪器仪器 电热恒温水浴电热恒温水浴 台式台式/低温离心机低温离心机 恒温摇床恒温摇床 恒温培养箱恒温培养箱 恒温水浴恒温水浴v材料材料 DH5DH5、TOP10TOP10 pUC18/19 pUC18/19 植物植物DNADNAv试剂试剂 X-gal IPTG X-gal IPTG BamHIBamHI T T4 4DNADNA连接酶连接酶操作步骤操作步骤v制备重组制备重组DNA DNA（1 1）在灭菌的在灭菌的Ep

19、pendorfEppendorf管（管（0.0.5ml5ml）中中,加入加入15l 15l pUC18,2l pUC18,2l酶切缓冲液，酶切缓冲液，1l1l（2U2U）BamHIBamHI酶酶,2l BSA 2l BSA （酶和缓冲液放在冰上酶和缓冲液放在冰上),),混合物总体混合物总体 积积2020ll，离心混匀离心混匀，37 37 反应反应3h3h。（2 2）在另一无菌管中，加入植物在另一无菌管中，加入植物DNA 1.5gDNA 1.5g，1l1l 酶切缓冲液，酶切缓冲液，1 1ll（2U2U）BamHIBamHI酶酶,2l BSA 2l BSA ，无菌水无菌水6 6.5l.5l，混合物

20、总体积混合物总体积1010l,l,离心混离心混 匀匀，3737反应反应3 3h h。操作步骤操作步骤（3 3）各取）各取 2 2ll酶解液做电泳分析。酶解液做电泳分析。（4 4）剩余酶解液加入）剩余酶解液加入1/101/10体积的体积的3 3mol/l mol/l KAcKAc(PH5.2)(PH5.2)溶液，再加溶液，再加2 2倍体积的无水乙醇，置倍体积的无水乙醇，置-20-20 冰冰 箱箱 2 2h h（沉淀沉淀DNADNA）。）。12000rpm 4 12000rpm 4 离心离心1515min,min,弃上清，加弃上清，加70%70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上乙醇洗沉淀物，再离心，去上

21、 清，倒置干燥，加清，倒置干燥，加 5 5lTElTE溶液溶解。溶液溶解。(替代方替代方 案：剩余酶解液案：剩余酶解液65 65,保温保温1515min)min)操作步骤操作步骤（5 5）将酶切后的将酶切后的2 2个个DNADNA片段混合于一管中，加片段混合于一管中，加T T4 4 DNA DNA 连接酶缓冲液连接酶缓冲液1 1ll，T T4 4DNADNA连接酶连接酶1 1ll，14 14 保温保温1414h h。（6 6）制备感受态细胞制备感受态细胞（Top10Top10）。）。（7 7）同时制备含同时制备含100100 g/ml g/ml氨苄青霉素的固体氨苄青霉素的固体LBLB培养培养

22、基，待培养基冷却，培养基（基，待培养基冷却，培养基（9090mmmm）中央滴加中央滴加 4040l 2%X-gall 2%X-gal和和7l 20%IPTG(7l 20%IPTG(Top10Top10不加不加)，用无菌涂棒使之均匀涂布于培养基表面，然后用无菌涂棒使之均匀涂布于培养基表面，然后37 37 温浴直至液体全部消失。温浴直至液体全部消失。操作步骤操作步骤（8 8）转化转化 第一组：第一组：5 5l(50ng)l(50ng)重组子重组子+200+200l l感受态细胞，感受态细胞，此管为转化实验组。此管为转化实验组。第二组：第二组：5 5ll无菌水无菌水+200+200l l感受态细胞悬

23、液。感受态细胞悬液。（9 9）实验组、对照组分别取）实验组、对照组分别取8080ll悬液均匀涂布在含悬液均匀涂布在含 X-galX-gal、AmpAmp的固体的固体LBLB培养基和含培养基和含AmpAmp的固体的固体LBLB培培 养基上；再取养基上；再取4040ll悬液均匀涂布普通固体悬液均匀涂布普通固体LBLB培培 养基上，养基上，37 37 过夜培养过夜培养实验结果实验结果含含X-galX-gal、AmpAmp的固体的固体LBLB培养基培养基 白色菌落（重组子）和兰色菌落（白色菌落（重组子）和兰色菌落（pUC18pUC18）兰色菌落（兰色菌落（pUC18pUC18）或无菌落或无菌落含含Am

24、pAmp的固体的固体LBLB培养基培养基 有菌落有菌落 无菌落无菌落普通固体普通固体LBLB培养基培养基 有菌落有菌落 无菌落无菌落成功成功成功失败成功失败实验实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备一、大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的实验目的了解制备感受态细胞的的意义了解制备感受态细胞的的意义掌握大肠杆菌感受态细胞的制掌握大肠杆菌感受态细胞的制 备方法和技术备方法和技术掌握感受态细胞的保存方法掌握感受态细胞的保存方法v感受态感受态v感受态细胞感受态细胞v原理：受体细胞经过一些特殊方法（如原理：受体细

25、胞经过一些特殊方法（如：CaCl2 等化学试剂法或电击法）的处理后，细等化学试剂法或电击法）的处理后，细 胞膜的通透性发生变化，成为能容许多胞膜的通透性发生变化，成为能容许多 有外有外源源DNA的载体分子通过的感受态细的载体分子通过的感受态细 胞胞v基本方法：细菌经基本方法：细菌经0 的低的低渗渗CaCl2处理，使细处理，使细 菌处于感受态，然后加入甘油菌处于感受态，然后加入甘油-70条件条件 下保存下保存 v材料材料 大肠杆菌大肠杆菌DH5DH5 TOP10 TOP10v试剂试剂 0.1molL CaCl2溶液溶液 LBLB培养基（液态培养基（液态）v仪器仪器 超净工作台超净工作台 电热恒温

26、水浴电热恒温水浴 分光光度计分光光度计 低温离心机低温离心机 制冰机制冰机 操作步骤操作步骤（1）从）从 DH5(或或TOP10)菌平板上挑取一单落，菌平板上挑取一单落，接种于接种于15ml LB液体培养基中，液体培养基中，37振荡培振荡培 养养12h左右。左右。（2）取该菌悬液）取该菌悬液150l 转接于转接于15ml LB液体培养液体培养 基中，基中，37振荡培养振荡培养2h左右（左右（OD6000.5）（3）将菌液转移到将菌液转移到10ml离心管（每管离心管（每管8ml），），放放 冰冰上上10min。（4 4）离心离心1010minmin（4000r/min4000r/min），），回

27、收细胞（从这一回收细胞（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快 而稳）而稳）。（5 5）倒净上清培养液）倒净上清培养液(倒置倒置1 1 min)min)，用用1.61.6mlml冰冷的冰冷的 0.10.1mo1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞，立即放在立即放在 冰上冰上30 30 min min。（6 6）44离心离心1010minmin（5000r/min5000r/min），弃上清液，回收弃上清液，回收 细胞。细胞。操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤（7 7）用）用320320ulul冰冷的冰冷的0.10.

28、1mo1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液轻轻轻轻 悬浮细胞，悬浮细胞，立即放在冰上立即放在冰上 。（8 8）分装细胞，每管）分装细胞，每管170170ulul细胞悬液再加细胞悬液再加3030ulul甘甘 油（灭菌）。油（灭菌）。（9 9）作标记，）作标记，-70-70保存。保存。实验实验 二、大肠杆菌的转化二、大肠杆菌的转化 及转化子的检测及转化子的检测实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的掌握感受态细胞转化的基本掌握感受态细胞转化的基本知识知识掌握大肠杆菌感受态细胞掌握大肠杆菌感受态细胞转转化化的方法的

29、方法了解感受态细胞转化的的意了解感受态细胞转化的的意义义v转化转化v原理原理:转化混合物中的外源转化混合物中的外源DNADNA形成形成抗抗DNADNA酶的羟酶的羟 基基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经4242 短时间热击处理，促进细胞吸收短时间热击处理，促进细胞吸收DNADNA复合物。复合物。转化是将异源转化是将异源DNADNA分子引入一细胞株系分子引入一细胞株系,使受使受 体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。因工程等研究领域的基本实验技术。v转化方法：转化方法：热击法、电转化法热击法、电转

30、化法仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂v仪器仪器 无菌超净台无菌超净台 电热恒温水浴电热恒温水浴 分光光度计分光光度计 低温离心机低温离心机 微型离心管微型离心管 移液器移液器v材料材料 感受态细胞感受态细胞 pUC18pUC18、pUC19pUC19v试剂试剂 CaClCaCl2 2溶液溶液 （0.0.1mol1molL L）LBLB培养基培养基 氨苄青霉素氨苄青霉素操作步骤操作步骤（1 1）分别取）分别取2 2个个200200l l感受态细胞悬液感受态细胞悬液 第一组第一组转化实验组：转化实验组：0.50.5l(50ng)pUC18/pUC19+200l(50ng)pUC18/pUC19+2

31、00l l感受态细胞感受态细胞 第二组第二组受体菌对照组：受体菌对照组：0.50.5l l无菌水无菌水 +200+200l l感受态细胞悬液感受态细胞悬液（2 2）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置3030minmin，于于 4242水浴中保温水浴中保温1.51.5minmin，然后迅速冰上冷却然后迅速冰上冷却 2 2minmin。操作步骤操作步骤（3 3）立即向上述管中分别加入）立即向上述管中分别加入0.80.8mlml LB LB液体培养液体培养 基（不需在冰上操作），使总体积到基（不需在冰上操作），使总体积到1 1mlml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于该溶

32、液称为转化反应原液，摇匀后于3737振振 荡培养约荡培养约1.51.5h h（170rpm170rpm）。（4 4）取各样品培养液取各样品培养液 0.10.1mlml，分别接种于含抗菌分别接种于含抗菌 素素LBLB平板培养基和普通平板培养基和普通LBLB平板培养基上，涂平板培养基上，涂 匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微 凉一下再用，不要过烫）。凉一下再用，不要过烫）。（5 5）菌液完全被培养基吸收后，倒置培菌液完全被培养基吸收后，倒置培 养皿，于养皿，于3737恒温培养箱内培养过恒温培养箱内培养过 夜夜(12-16(12-16小时小时)，出现菌落。，

33、出现菌落。操作步骤操作步骤实验结果实验结果v含抗生素含抗生素LB平板培养基平板培养基 第一组有菌落，第二组无菌落第一组有菌落，第二组无菌落 第一组、第二组均无或有菌落第一组、第二组均无或有菌落v 普通普通LB平板培养基平板培养基 第一组、第二组均无菌落第一组、第二组均无菌落 第一组、第二组均有菌落第一组、第二组均有菌落 成功成功失败失败失败失败成功成功实验一、碱变性法提取实验一、碱变性法提取 质粒质粒DNADNA实验目的实验目的相关知识及原理相关知识及原理仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂操作步骤操作步骤实验结果实验结果实验目的实验目的v学习掌握碱裂解法提取质粒学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的方

34、法和技能；的方法和技能；v学习掌握质粒学习掌握质粒DNA浓度、纯度的检测方法；浓度、纯度的检测方法；v学习掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法；学习掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法；v碱裂解法提取法碱裂解法提取法是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。pH介于12.012.5范围内，线性的DNA双螺旋解开变性；质粒DNA的氢键会断，但两链彼此盘绕。当恢复到中性时，质粒DNA复性迅速而准确；线性染色体DNA复性不迅速，而且缠绕形成网状结构，通过离心使他们分离。仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂v仪器仪器 恒温培养箱恒温培养箱 摇床摇床 电热恒温水浴电热恒温水浴 电泳仪电泳仪 低温

35、离心机低温离心机 紫外线透射仪紫外线透射仪v材料材料 pUCpUC 18/19 18/19v试剂试剂 溶液溶液/胰胰RNARNA酶酶 TETE缓冲液缓冲液操作步骤操作步骤（1 1）1515mlml的含的含氨苄氰霉素氨苄氰霉素LBLB培养基中接入上一培养基中接入上一 实验得到的转化子，实验得到的转化子，37 37 震荡培养震荡培养8 8h,h,加入加入 氯霉素（终浓度氯霉素（终浓度150 150 g/mlg/ml），），培养过夜。培养过夜。（2 2）取）取1.51.5mlml培养物倒入离心管中，培养物倒入离心管中，40004000r/minr/min离离 心心3min3min，吸去培养液，使细胞

36、沉淀尽可能干吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干 燥。燥。（3 3）将细菌沉淀悬浮于）将细菌沉淀悬浮于100 100 l l溶液溶液 （冰上预冷冰上预冷）中，剧烈振荡，室温放置中，剧烈振荡，室温放置5 5 minmin。操作步骤操作步骤（4 4）加加200 200 l l溶液溶液（新鲜配制）（新鲜配制），盖紧管皿，盖紧管皿，快速颠倒离心管快速颠倒离心管5 5次，混匀内容物，将离心次，混匀内容物，将离心 管放冰上管放冰上5 5 minmin。（5 5）加加150 150 l l溶液溶液（冰上预冷冰上预冷），盖紧管皿，），盖紧管皿，颠倒数次使其混匀，冰上放置颠倒数次使其混匀，冰上放置10 10 minm

37、in。（6 6）12000r/min12000r/min，离心离心5 5 minmin，将上清液转至另将上清液转至另 一离心管。一离心管。操作步骤操作步骤（7 7）向上清中加入等体积）向上清中加入等体积(约约450 450 l l)酚：氯仿：酚：氯仿：异戊醇（异戊醇（2525：24 24：1 1）（去蛋白），混合有）（去蛋白），混合有 机相和水相，机相和水相，1200012000rpm,rpm,离心离心5 min5 min，将，将上清用上清用 移液器移液器集中集中转移到另一离心管中（小心移液，转移到另一离心管中（小心移液，不要把分界面的蛋白质吸入）。不要把分界面的蛋白质吸入）。（8 8）向上清

38、加入）向上清加入2 2倍体积无水乙醇，混匀后，室温倍体积无水乙醇，混匀后，室温 放置放置1010minmin，12000rpm12000rpm离心离心5 5minmin。去上清液，去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁液体。把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁液体。操作步骤操作步骤（9 9）用）用4 4ml70%ml70%乙醇（乙醇（-20-20 预冷预冷）洗涤质粒）洗涤质粒 DNADNA沉淀，振荡并离心沉淀，振荡并离心(12000(12000rpm,5min)rpm,5min)，倒倒 去上清夜，晾干。去上清夜，晾干。（1010）加）加100100l l TETE缓冲液，其中含有缓冲液，其中含有2020 g/mlg/ml的的 胰胰RNARNA酶酶(2 2l l，1mg/ml RNA1mg/ml RNA酶酶)，使，使DNADNA完全完全 溶解，溶解，20 20 保存。保存。