分离工程第八章课件.ppt

1、本章主要知识点本章主要知识点w 电泳：是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。w 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。w 20世纪初，电泳法用于蛋白质的分离，20世纪70年代，电泳多用于分析目的。w（1）自由电泳：是最早的一种电泳形式，目前已很少使用。w瑞典管内蛋白质溶液和缓和液间有清晰可见界面，然后加一电场，由于界面处存在浓度梯度因而产生折射梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面的移动。w 在电泳过程中，每个移动的界面相当于某一特定的蛋白质，通过一定计算可得其泳动度。/cm)E(V(cm/s)伏特电场强度泳动速度泳动度（迁移率）w 缺点：电泳中因通电发热等原因而引起

2、的对流，常回使已分离的溶质重新混合，为防止对流，可将电泳在多孔介质中进行，称为区带电泳。w 区带电泳：应用支持介质的电泳，它表示在一个电场的作用下，在某一支持物上能将一个样品组成彻底分离成若干条区带的过程。w（2）区带电泳：在支持物上电泳时蛋白质混合物被成若干区带。w 根据支持物物理性质的不同可分为4类：w 滤纸电泳和薄膜电泳，粉末电泳，细丝电泳，凝胶电泳。w 多孔介质称为载体，应用最普通的是以滤纸或凝胶为载体故称为纸电泳法或凝胶电泳法。第一节 凝胶电泳法w 凝胶电泳的作用是基于凝胶过滤作用（分子筛作用）和电泳淌度的双重机理，所以它能获得较高的分辨率。w 凝胶电泳：凝胶过滤作用（分子筛作用）电

3、泳淌度正比于 电荷数（电荷效应）w 单位电场强度下的运动速度称为离子淌度或迁移率。ABC+-w 常用的凝胶材料：聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶。w 聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）单体是神经毒素，可积累。w 凝胶电泳使用的凝胶种类和浓度根据分离料液中溶质的相对分子质量而异。w 聚丙烯酰胺含量 适用的分子量范围w 7.5%凝胶 10kD1000kDw 3.5%凝胶 1000kD5000kDw 琼脂糖或琼脂糖 与聚丙烯酰胺混合物 5000kDw 孔径从小到大。垂直电泳槽及灌胶模具垂直电泳槽及灌胶模具聚丙酰胺电泳凝胶电泳与凝胶过滤的区别w 在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的运动速度是小分子大于大分子物质，这种凝胶过滤

4、中的情况恰好相反，这是因为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积，只有充满整体凝胶的网状骨架，因此在其内部大分子物质不及小分子物质容易移动。w 凝胶电泳：装柱操作，铺板操作。w 近来聚丙烯酰胺凝胶电泳法有了两个新进展：w A、不连续凝胶电泳。w B、十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。w 1、不连续凝胶电泳：w 不连续凝胶由两层组成，上层为浓缩层（丙烯酰胺23%），下层为分离层（丙烯酰胺525%）。w 聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为支持物，制成凝胶柱。w 凝胶柱由二节凝胶组成（小节浓缩胶，大节分离胶）。这二节胶孔径大小，缓冲液离子成分和离子强度值，电场强度都是不同的。w样品先被压缩一个薄

5、层，然后进行电泳。w一般经过三个效应，浓缩效应，分子筛效应，电荷效应，使样品分离效果好，分辨率高。w 2、十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳w 一种加阴离子去污剂SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳。w 主要用途：w 分离蛋白质和测定它的相对分子量。w 基本原理：w SDS能以一定比例与蛋白质结合，并使蛋白质带有大量的负电荷，（大大超过原来所带电荷），从而使天然蛋白质分子之间电荷差别下降乃至消除。同时蛋白质的结构也在 SDS作用下变的松散（蛋白质变成多肽），形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS聚丙烯酰胺电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。w LgM =A -KRmw

6、M相对分子量w A常数w K斜率w Rm迁移率w 由于蛋白质结合SDS的量与蛋白质种类、pH、I、缓冲液组成有关。一般都必须用已知相对分子量蛋白质作为指示蛋白质、与被测样品在同一条件下进行电泳，给出LgM Rm曲线，求出样品Rm值对应的LgM，计算出被测样品相对分子量。第二节 等电点聚焦w 等电点聚焦（IEF)：利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。w 在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到各自等电点的 pH区域形成具有不同等电点的蛋白质区带。w 等电聚焦原理示意图w 装置:w 特点：w 优点：消除分子扩散

7、引起的分离度下降。w 缺点：1、载体两性电解质对产品产生污染；2、pH梯度的稳定性不高；3、操作过程中发生凝胶脱水起皱现象。思考题w 1、氨基酸的等电点（pI)是指。w 2、用纸电泳法分离氨基酸主要是根据氨基酸的极性不同。w 3、测定别构酶的相对分子量可以用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。w 4、某蛋白质在pH 6时向阳极移动，则其等电点小于6。w 选择题w1、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（）wA、在一定pH条件下所带静电荷不同wB、分子大小不同wC、分子极性不同wD、溶解度不同wE、以上说法都不对w2、将抗体固定在层析柱的载体上，使抗原从流经此柱的蛋白质样品中分离出来，这技术属于（）wA、吸附层析wB、离子交换层析wC、分配层析wD、亲和层析wE、凝胶过滤w 回答题w1、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯凝胶电泳这两种分离蛋白质的方法均建筑在分子大小的基础之上，而且两种方法均采用交联的多聚物作为支持介质，为什么在凝胶过滤时，相对分子质量小的蛋白质有较长的保留时间，而SDS-聚丙烯凝胶电泳时，它又跑的最快？本课程的课堂讲授内容到此全部结束本课程的课堂讲授内容到此全部结束谢谢大家！谢谢大家！