两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件.ppt

1、两水相萃取过程的选择性两水相萃取过程的选择性(1)(1)细胞，细胞碎片影响分配（粘度）细胞，细胞碎片影响分配（粘度）总分配系数总分配系数(2)(2)亲和两水相分配亲和两水相分配(3)(3)液体离子交换剂液体离子交换剂两水相两水相体系发展中的问题体系发展中的问题 相体系回收相体系回收(1)(1)环境环境(2)(2)成本成本成相聚合物的回收成相聚合物的回收(1)(1)压力敏感型两水相压力敏感型两水相(2)(2)热促相分离高聚物热促相分离高聚物EO-POEO-PO(3)pH(3)pH敏感型高聚物（聚两性离子高聚物敏感型高聚物（聚两性离子高聚物,多聚电解质多聚电解质)(4)(4)光敏感相分离高聚物光敏

2、感相分离高聚物压力诱导相分离压力诱导相分离加氨基酸对相图的影响加氨基酸对相图的影响加加氨基酸氨基酸对相对相密度的影响密度的影响氨基酸的分离配系数氨基酸的分离配系数系线系线长度与分配系数长度与分配系数热诱导相分离热诱导相分离EO-PO-HP-EOPO高聚物结构式高聚物结构式相体系回收示意图相体系回收示意图相相 图图盐的分配盐的分配蛋白纯化蛋白纯化EOPO-HPEOPOEOPO-HPEOPO高聚物回收高聚物回收pH pH 诱导相分离诱导相分离RecycleLight Light H2CCHCOHNCHCH3CH3H2CCHCOORR1H2CCHCOHNCHCH3CH3H2CCHCOORR1*光敏感

3、聚合物合成光敏感聚合物合成systems1(%w/w)2(%w/w)3(:%w/w)two-phasesPNBC：PEG60003.3:6.72.5:103.0:8.0noPNBC：PEG200003.3:6.72.5:103.0:8.0noPNBC：PPG3.3:13.32.5:203.0:16turbidPNBC：Dex200003.3:3.32.5:6.73.0:4.0yesPNBC：SDS3.3:6.72.5:103.0:8.0turbidPNBC：Tween 3.3:33.32.5:503.0:40noPNBC：EO30PO703.3:6.72.5:103.0:8.0noPNBC：I

4、PA3.3:33.32.5:503.0:40noPNBC：（：（NH4）2SO43.3:6.72.5:103.0:8.0precipitation0246810120246810PNBC(%)Dex(%)123459596979899100Recovery(%)R ecycle num bers of polym er123N a C lN a 2 S O 4N a 3 P O 4N a C lO 47 07 58 08 59 09 51 0 0Recovery(%)th e rm a l re c o v e ry lig h t re c o v e ry 两水相系统的应用两水相系统的应用

5、1.蛋白质纯化蛋白质纯化2.抗生素，氨基酸，天然成分抗生素，氨基酸，天然成分3.酶相转移催化酶相转移催化4.细胞器分离细胞器分离02468101214020406080100120盐浓度（mM）分配系数kNaCl系统Na2SO4系统NaClO4系统Na3PO4系统KCl系统K2SO4系统K3PO4系统KSCN系统图图 6 6APAAPA在系列盐系统中的分配系数在系列盐系统中的分配系数K K 全回用两水相体系意义：意义：1.1.合成可再生的聚合物。合成可再生的聚合物。2.2.构建两水相体系，使两相均能回收构建两水相体系，使两相均能回收3.3.较好的分离效果。较好的分离效果。内容：内容：1.1.以

6、异丙基丙烯酰胺（以异丙基丙烯酰胺（NIPANIPA）、乙烯基、乙烯基 吡咯烷酮吡咯烷酮（NVPNVP）、叶绿酸铜钠（）、叶绿酸铜钠（CHLCHL）三单体合成可再生光）三单体合成可再生光 敏感聚合物敏感聚合物P PNNCNNC2.P2.PNNCNNC与另一与另一pHpH敏感聚合物敏感聚合物P PADBADB成相成相3.3.应用该可再生两水相体系应用该可再生两水相体系合成聚合物PNNC示意图R1：C H2H CONCH3C3H8R 4NCC H3CNC uR 5CH3HHC H2C H2R 5HNH2CCHCOHNCHCH3CH3mH2CCHNOnR1kH2CCHCOHNCHCH3CH3H2CCH

7、R1mnkNO2.2.聚合物聚合物P PNNCNNC的合成与表征的合成与表征(1)(1)聚合物聚合物P PNNCNNC的单体比例选择的单体比例选择 聚合物聚合物PNNC(NIPA:NVP:CHL)摩尔比摩尔比196:4:1196:6:1196:8:1196:10:1196:20:1LCST（）33.432.131.829.428.6选取的单体摩尔比为选取的单体摩尔比为196：8：1成相物质成相物质浓度浓度与与10%聚合物溶液聚合物溶液 成相情况成相情况PEG2000010%不成相30%不成相PEG1000010%不成相25%不成相DEX2000010%成相20%成相30%成相PPG40%不成相

8、EOPO 406010%不成相30%不成相EOPO 307030%不成相（NH4）2SO430%沉淀SDS20%不成相羧甲基纤维素羧甲基纤维素钠钠3%沉淀PNBC10%不成相PABC5%不成相 PADB5%成相1.1.聚合物的成相聚合物的成相通过成相实验和相图，确通过成相实验和相图，确定使用的两水相体系为定使用的两水相体系为 PNNC(10%)/PADB(5%)CH2CxCH3COOCH2CH2NCH3CH3CH2CCH3COOHyCH2CCH3COzOCH2CH2CH2CH3绘制相图01234567802468101214161820 CPNNC /%PADB /%TBM采用采用 节点检测法

9、节点检测法 BACK 两水相成相、分相、聚合物回收示意图溶液浓度溶液浓度溶液体积溶液体积1mL0.8mL0.5mL616min15min10min10%22min20min15min聚合物质量聚合物质量（g）0.0300.0480.0600.0500.0800.100时间（时间（min）1015161520221g聚合物沉淀平均所需要的照射时间为聚合物沉淀平均所需要的照射时间为266分钟分钟由公式：由公式：Q=W*T 1g聚合物沉淀大概所需要吸收的激光能量为聚合物沉淀大概所需要吸收的激光能量为4.8kJ1度电能够使度电能够使750g聚合物沉淀聚合物沉淀2.聚合物聚合物PNNC光照回收光照回收（

10、1）聚合物）聚合物PNNC的光照条件的光照条件 采用激光输出功率为采用激光输出功率为300mw，照射点的面积为，照射点的面积为1.77*10-6m2（2）单水相PNNC溶液光照回收（3）单水相PNNC溶液重复回收实验组别组别空白空白NaClNa2SO4Na3PO4Na4P2O7NaClO4KSCN光照沉淀光照沉淀时间时间（min）15141516121613回收率回收率（）（）99.599.899.193.399.699.899.7123459 09 29 49 69 81 0 0回回收收率率(%)回回 收收 次次 数数96.8（4）两水相两聚合物回收实验（5）两水相两聚合物重复回收实验组别组

11、别空白空白NaClNa2SO4Na3PO4Na4P2O7NaClO4KSCN光照沉淀时光照沉淀时间（间（min）15141516121613PNNC回收率回收率(%)95.598.197.093.396.696.898.7PADB回收率回收率(%)97.098.197.697.398.697.598.3123459092949698100回回收收率率 /%回回 收收 次次 数数 PN N C PA D B95.5%BACK3.蛋白质在两水相体系中的分配蛋白质在两水相体系中的分配（1）盐种类对溶菌酶及牛血清白蛋白（BSA）分配的影响（均采用20mM无机盐）0.00.51.01.52.02.53.

12、03.54.04.5分 配系数K 溶菌酶 BSA空白 NaClNa2SO4Na3PO4Na4P2O74.氨基酸的分配实验氨基酸的分配实验(1)(1)盐种类对氨基酸分配的影响盐种类对氨基酸分配的影响 采用色氨酸（采用色氨酸（Trp），），酪氨酸（酪氨酸（Tyr）为试样为试样0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5空白空白Na4P2O7Na3PO4Na2SO4NaCl分 配系数K Tyr Trp1.通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物PNNC 粘均分子量约为粘均分子量约为7.1103。2.选取的成相体系为选取的成相体系为10（

13、w/w）PNNC与与5（w/w）PADB，成相体积比为成相体积比为1：3。两水相中两聚合物多次光回收和。两水相中两聚合物多次光回收和pH回收都在回收都在95.5到到98.7之间，一定程之间，一定程度上解决了聚合物回收率低的问题。度上解决了聚合物回收率低的问题。3.以氨基酸、蛋白质等生物物质为研究对象，考察该两水相系统的性质。其中以氨基酸、蛋白质等生物物质为研究对象，考察该两水相系统的性质。其中Tyr、Trp的最佳分配系数分别为的最佳分配系数分别为0.12、6.25；溶菌酶、；溶菌酶、BSA的最佳分配系数的最佳分配系数分别为分别为0.11、4.2。4.该两水相体系对乳酸小分子的分配系数均接近于该

14、两水相体系对乳酸小分子的分配系数均接近于1，最大分配系数只有，最大分配系数只有2.30。5.在乳酸的分配模型关联中，朱自强改进的在乳酸的分配模型关联中，朱自强改进的D-H模型模型 相关性最好，说明在相关性最好，说明在PNNC浓度浓度8.012.0范围内，该模型对乳酸在范围内，该模型对乳酸在PNNC/PADB两水相体系中分配系数关两水相体系中分配系数关联最为准确。联最为准确。结论pH敏感型可回收丙烯酸类两性高聚敏感型可回收丙烯酸类两性高聚物的合成及其在两水相中应用物的合成及其在两水相中应用 意义：1 构建两种成相聚合物均可回收的新两水相体系 （PNBC/PADB）2 较高的回收率（95）3 操作

15、条件相对温和采用丙烯酸（AA），甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA），甲基丙烯酸丁酯（BMA）PADB反应示意图：CH2CCH3CH2OCH2COCOCH2OCH3NCH3CH3yCCH2COCH3CH2zCH2CHxCH2COOHCH2CHOHCH2CH3COxCH2COCH2CH3CH2NCH2CH3CH2COOCH3CH3CH2Cyz+APSNaHSO3/55.24h无规聚合通过1H NMR中单体上特征氢，计算得到三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；投料比为19.7：7.24：14.聚合物成相实验聚合物成相实验成相物质浓度与5聚合物溶液成相情况 PEG200

16、005不能成相8不能成相10可成相15可成相20可成相30产生沉淀PEG1000020不能成相30下相沉淀DEX2000010不成相30不成相(NH4)2SO430不成相Na3PO430不成相PNBC10成相15成相PABC5不成相PNNC10不成相PNNBC5不成相选择由pH敏感型聚合物PADB和光敏感聚合物PNBC组成两种成相聚合物均可回收的两水相体系。5.相图相图PADB浓度PNBC浓度TBMC选择由10%(w/w)PNBC/5%(w/w)PADB组成两水相体系，2.无机盐种类及浓度对聚合物无机盐种类及浓度对聚合物PADB单水相回收影响单水相回收影响 1.未加无机盐,2.NaCl；3.K

17、Cl；4.Na2SO4；2.5.（NH4）2SO4；6.Na3PO4；7.Na4P2O73.单水相聚合物单水相聚合物PADB多次循环使用的得率多次循环使用的得率8082848688909294969810012345回收次数回收率（）40mM Na3PO4对照96.798.64.无机盐种类对两水相无机盐种类对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响聚合物回收影响1.NaCl；2.KCl；3.Na2SO4 ；4.（NH4）2SO4；5.Na3PO4；6.NaClO4 98.796.880828486889092949698100123456无机盐种类(10mM)回收率(%)PNBC回收率PADB回

18、收率5.无机盐浓度对两水相无机盐浓度对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响聚合物回收影响909192939495969798991000204060801001201404回收率（）PNBC的回收率PADB回收率Na3PO4浓度(mM)98.698.26.多次回收对两水相多次回收对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响聚合物回收影响909192939495969798991000123456回收次数回收率（）PNBC回收率PADB回收率97.896.73.无机盐种类及浓度对分配系数的影响无机盐种类及浓度对分配系数的影响 27.51.没加无机盐；2.NaCl；3.KCl；4.KBr；5.NaH

19、SO3；6.Na2SO4；7.Na3PO4；8.Na4P2O7 结结 论论1.通过自由基无规聚合，合成了pH敏感型的可回收丙烯酸类两性聚合物PADB，其粘均分子量约为3.7104，聚合物中三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；2.由10（w/w）PNBC/5（w/w）PADB组成两种成相聚合物均可回收的两水相体系，成相体积比为1：2。经过五次循环使用后聚合物PNBC的回收率为97.8；PADB的回收率96.7；3.该两水相体系对大分子有较好的分离效果，其中BSA最大分配系数可达27.5；溶菌酶的最大分配系数可达0.49；Phase transfer bioconver

20、sion of penicillin G into 6-APA by immobilized penicillin acylase in recycling aqueous two-phase systems with light-pH sensitive copolymersenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeRelation between 6-APA partition coefficient and inorganic salts Top(g/L)bottom(g/L)K6-APA 0.81 0.80 1.01Phenylac

21、etic acid 0.67 0.69 0.97PG（Na）0.39 0.39 1.00 Salts conc.0.5%（w/w）1.0%(w/w)1.5%(w/w)MgCl2 0.99 0.99 0.94NaCl 3.56 5.78 1.53NaHSO3 0.8 0.73 0.38Na3PO4 2.21 1.49 0.44KI 0.54 0.37 0.32MgSO4 1.64 2.00 0.47Na2SO4 0.32 0.54 0.53KH2PO4 0.7 0.8 0.73Partition coefficients change of substrate and products duri

22、ng060120180240300360420480t/min012345678Partition coefficient(K)6-APA Penicillin G(Na)Phenylacetic acid Conc.Change of phenylacetic acid and 6-APA during bioconversios0100200300400500Time(min)0102030405060708090100 phenyacetic acid in top phase phenyacetic acid in bottom phase06012018024030036042048

23、0Time(min)010203040506070806-APA conc.(g/L)6-APA top phase 6-APA bottom phaseConc.Change of 6-APA in top and bottom phaseConc.Change of Phenylacetic acid in top bottom phaseTotal yield of 6-APA in top and bottom phase0100200300400500t/min1020304050607080901006-APA total yield in two phase(%)小小 结结 1

24、Immobilized penicillin acylase was used for bioconversion of penicillin G into 6-APA in ATPS with PNBC and PADB.2 K6-APA 5.78(containing1%NaCl).Reaction time at 7h or so.The 6-APA mole yields 85.3%(pH 7.8,and 20)3 K 6-APA and K phenylacetate acid was significantly changeable during reaction.4 PNBCco

25、uld be recovered by laser radiation at 488 nm or filtrated 450 nm light,PADB could be recovered by isoelectric point(pH 4.1).The recovery of the two copolymers was 96-99%.5 The bioconversion could be performed at 20 C due PNBC phase separation.表面活性剂水胶束两水相体系表面活性剂水胶束两水相体系概述：概述：表面活性自组装成分子多聚体（胶束），疏水基向内形

26、成胶 核，亲水基向外，当温度在浊点以上时，发生分相。与传统两水相的比较：与传统两水相的比较：(1)产生两水相只需要表面活性剂与水(2)通过控制温度，表面活性剂浓度，盐等可改变胶束大小与形状(3)提供两亲性环境，一般更适合憎水性生物分子(4)通过引进亲和配基或电性基团，增加选择分离效果(5)通过过滤等手段可方便地将胶束与生物分子分离。组成两水相的表面活剂组成两水相的表面活剂vTrixton-X 100,114vCiEOj 阴阳离子表面活性剂组成的两水相阴阳离子表面活性剂组成的两水相v概述：概述：当阴，阳两种离子性表面活剂在临界胶束浓度（CMC）以上混合时形成两水相，上相富含表面活性剂，下相则很少

27、v性质：性质：（1）能提供两亲性环境，适合水不溶性蛋白萃取（2）胶束的大小与形状可控（3）胶束表面电荷可控，增加电荷选择性（4）通过稀释或温度变化形成沉淀回收表面活性剂（5）易于操作（低浓度，低粘度，快速分相）表面活性剂表面活性剂（1）辛基三甲基溴化铵）辛基三甲基溴化铵(OTAB)与辛基硫酸钠与辛基硫酸钠(SOS)（2）溴化）溴化十二十二烷基三乙胺烷基三乙胺(C 12 NE)十二十二烷基磺酸钠烷基磺酸钠（SDS）（3）辛基三甲基溴化铵辛基三甲基溴化铵(OTAB)十或十二十或十二烷基磺酸钠烷基磺酸钠（C10S,或或 C12S)思考题思考题1 两水相萃取应用中最突出的问题是什么？两水相萃取应用中最突出的问题是什么？如何解决？如何解决？2 两水相有几类？如何形成两水相？两水相有几类？如何形成两水相？3 当前两水相体系的回用有哪些方法？其当前两水相体系的回用有哪些方法？其原理是什么原理是什么?