（生物工程下游技术）第七章双水相萃取课件.ppt

1、第七章第七章 双水相萃取技术双水相萃取技术 溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相下，水相也可以形成两相(即双水相系统即双水相系统)甚至多相。于是有甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。到另一水相中，从而完成分离任务。有机溶剂萃取的不足：有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质许多蛋白质都有都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。聚

2、合物的不相溶性：聚合物的不相溶性：v 主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗 透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的 水相，所以具有强烈的相分离倾向。水相，所以具有强烈的相分离倾向。v 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓 度达到一定值，也会形成两相，即聚合物度达到一定值，也会形成两相，即聚合物盐双水相体系盐双水相体系 系统含水量多达系统含水量多达75%75%90%,90%,两相界面张力极低两相界面张力极低,有助于有

3、助于保持生物活性和强化相际间的质量传递保持生物活性和强化相际间的质量传递 分相时间短分相时间短(特别是聚合物特别是聚合物/盐系统盐系统),),自然分相时间一般自然分相时间一般只有只有5 515min15min。双水相萃取技术易于连续化操作。双水相萃取技术易于连续化操作。目标产物的分配系数一般大于目标产物的分配系数一般大于3,3,大多数情况下大多数情况下,目标产物目标产物有较高的收率。有较高的收率。大量杂质能够与所有固体物质一起去掉大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液与其它常用固液分离方法相比分离方法相比,双水相萃取技术可省去双水相萃取技术可省去1 12 2 个分离步骤个分离步骤,

4、使使整个分离过程更经济。整个分离过程更经济。设备投资费用少设备投资费用少,操作简单操作简单,不存在有机溶剂残留问题。不存在有机溶剂残留问题。双水相萃取技术的优点双水相萃取技术的优点一、一、双水相分离理论双水相分离理论1、双水相的形成双水相的形成 v熵增熵增混合混合自发自发v分子间作用力分子间作用力-随着随着Mr的增加的增加,而增大而增大.v聚合物的不相容性聚合物的不相容性-含有聚合物分子的溶液发含有聚合物分子的溶液发生分相的现象生分相的现象.常用聚合物：常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇无机盐系统聚乙二醇无机盐系统无毒原则无毒原则2、相图、相图 临界点临界点(critical p

5、oint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如C点。均相区两相区双节线系线u聚合物的分子量越高，相分离聚合物的分子量越高，相分离 所需的浓度越低所需的浓度越低u两种聚合物的分子量相差越两种聚合物的分子量相差越 大，双节线的形状越不对称大，双节线的形状越不对称。3、物质在两相中的分配、物质在两相中的分配 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。表示。CT K=CB Ct、CB分别代表上相、下相中溶质的浓度分别代表上相、下相中溶质的浓度 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。与

6、温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。1）表面自由能的影响）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对大分子物质表面性质对K影响很大影响很大)2）表面电荷的影响）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐盐效应：两相系统中如存在盐,对对K影响较大影响较大)3）综合考虑）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响；聚合物的影响；(2)体系中无机盐离子的影响；体系中无机盐离子的影响；(3)体系体系PH的影响；的影响；(4)体系温度的影响；体系温度的影响

7、；(5)体系中微生物的影响。体系中微生物的影响。1）表面自由能的影响）表面自由能的影响2）表面电荷的影响）表面电荷的影响道南电位道南电位(,Donnan potential):实际双水相系统中有电解质实际双水相系统中有电解质,当这些离子在两相中当这些离子在两相中K 1,则两相间产生电位差则两相间产生电位差U2，U1相相1 1和相和相2 2的电位的电位 Z+,Z 分别表示一种盐的正负离子的离子价分别表示一种盐的正负离子的离子价 FF法拉第常数法拉第常数 T温度温度v进一步可证明：进一步可证明：InKi*=InKi+ZiF(U2-U1)RTKi*i组分带电时在体系中的分配系数组分带电时在体系中的分

8、配系数 Kii组分不带电时在体系中的分配系数组分不带电时在体系中的分配系数 Zii组分的离子价组分的离子价意义：意义：A 荷电溶质的分配系数的对数与荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比溶质的净电荷数成正比.B 由于同一双水相系统中添加不由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的同的盐产生的不同不同,故故k与与Zi的的关系因盐而异。关系因盐而异。3）综合考虑）综合考虑4）影响分配平衡的参数）影响分配平衡的参数(1)聚合物的影响聚合物的影响vA A 聚和物的分子量的影响聚和物的分子量的影响 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物

9、的相。例如在相。例如在PEGDeX系统中，系统中，PEG的分子量减小，会使分的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。(P135)vB B 成相聚和物浓度的影响成相聚和物浓度的影响 当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于于1。如成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，如成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线

10、的长度也增加，此时两相性质的差别系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减小低于，或减小低于1。(2)体系中无机盐离子的影响体系中无机盐离子的影响v盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说萃取来说,盐的存在就会使系统的电荷状态改变盐的存在就会使系统的电荷状态改变,从而对分从而对分配产生显著影响。配产生

11、显著影响。（P137）v盐的种类对双水相萃取也有一定的影响盐的种类对双水相萃取也有一定的影响,因此变换盐的种类因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性。和添加其他种类的盐有助于提高选择性。v在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐磷酸盐/水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到提高到 1 2 0,而在而在 PEG/DeX/水体系中只从水体系中只从 1.55提高到提高到 5。(3)体系体系PH的影响的影响vpH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白会影响蛋白质中可以离解基

12、团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。质所带电荷和分配系数。vpH也影响磷酸盐的离解程度，若改变也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和和HPO42-之间之间的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变23个数量级。个数量级。交 错 分 配 法交 错 分 配 法(c r o s s partitioning):当加入不当加入不同种类的盐时，由于相间电同种类的盐时，由于相间电位不同，位不同，lnlnk kpHpH关系曲线关系曲线也不一样。但在也不一样。但在p

13、IpI处，处，k k应应相同，即两条关系曲线交于相同，即两条关系曲线交于一点。所以一点。所以,通过测定不同通过测定不同盐类存在下盐类存在下lnlnk kpHpH曲线的曲线的交点交点,可测定蛋白质可测定蛋白质/细胞器细胞器以及微粒的以及微粒的pIpI。血清蛋白血清蛋白(4)体系温度的影响体系温度的影响 温度影响小温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取。一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操大规模操作一般在室温下进行作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：不需冷却。这是基于：(1)(1)成相聚合物成相聚合物PEGPEG对蛋白质有稳定作用对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会常温下蛋白质不会 发生变

14、性发生变性;(2)(2)常温下溶液粘度较低常温下溶液粘度较低,容易相分离容易相分离;(3)(3)常温操作节省冷却费用常温操作节省冷却费用.二、二、双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 1.双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。目前已知的胞内酶约目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离碎片存在，欲将细胞

15、碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。及酶的进一步精制。欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；经过一次萃取，就能得到高的收率；两相用离心机很容易分离。两相用离心机很容易分离。工程方面的问题工程方面的问题 在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。间和两相分离的设备。在两水相系统中

16、，虽黏度高，但表面张力很低。因而进在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且能耗也很少。能耗也很少。两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采用自动排渣的喷嘴分离机。用自动排渣的喷嘴分离机。PEG/盐更适合用重力沉降；盐更适合用重力沉降；PEG/DeX多用离心机多用离心机。在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以在两水相系统中进行转化翻译

17、功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。器。2.两水相反应器两水相反应器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzyme要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：要进行两水相生物转

18、化反应应满足下列条件：催化剂应单侧分配；催化剂应单侧分配；底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。则相比要大，反之则相比要小。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此常需要根据试验选择最优系统和操作条件。常需要根据试验选择最优系统和操作条件。采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体与固定床反应器

19、相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在滴在10m m以下，有很大的表面积，有利于底物和以下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。产物的传递。三、三、双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 1.PEG衍生物：在衍生物：在PEG上引入亲和基团或离上引入亲和基团或离 子基团；子基团；2.采用多级萃取。采用多级萃取。作业：作业：第七章第七章

20、 双水相萃取双水相萃取1.1.普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是：普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是：(1)(1);(2);(2)2.2.生物工程中常用的双水相体系主要生物工程中常用的双水相体系主要 有：有：，等体系。等体系。3.3.聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）/葡聚糖（葡聚糖（DexDex）体系的相图是一条双节）体系的相图是一条双节线。双节线线。双节线 下方为下方为 ，双节线上方即，双节线上方即 为为 ，两相分别有不同的组成和密度。上相主要，两相分别有不同的组成和密度。上相主要 含含 ，下相主要含，下相主要含 。4.4.在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（PEGPEG）/葡聚糖葡聚糖（DexDex）双水相体系中分配的因素有哪些）双水相体系中分配的因素有哪些?分配系数分配系数K K分别怎分别怎 样变化样变化?5.5.请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。