内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤培训课件.ppt

1、内皮祖细胞微囊泡肾内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤脏缺血再灌注损伤文献介绍文献介绍l来源：Kidney International;published online 11 April 2012.l作者：Vincenzo Cantaluppi et al.l科研机构：University of Torino,Torino,Italy.内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤2内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤3文献摘要文献摘要l内皮前体细胞通过旁分泌具有逆转急性肾损伤的作用。l从前体细胞分泌的微囊泡通过mRNA水平的转移激活了内皮细胞的血管形成程序。l微囊泡中的RNA富含miRNA，这些miRNA能

2、够调节细胞增殖、促进血管形调节细胞增殖、促进血管形成、抗凋亡。成、抗凋亡。l缺血再灌注后，通过静脉注射微囊泡，这些囊泡主要集中在管周毛细血管、肾小管上皮细胞。l通过促进肾小管上皮细胞增殖，减少凋亡和白细胞浸润对肾小管的形态和功能的保护。l微囊泡也能通过抑制毛细血管稀疏化、肾小球硬化和管周间质纤维化来延缓慢性肾损伤的进程。l这些微囊泡的保护作用在经过RNase 的预处理、通过敲除祖细胞的Dicer基因来非特异性的抑制祖细胞中miRNA的产生、通过转染特异性的miR-antagomirs 来使促血管生成的miR-126和miR-296表达减少。l因此，内皮祖细胞来源的微囊泡通过它们的内皮祖细胞来源

3、的微囊泡通过它们的RNA成分来保护肾脏免受缺血造成分来保护肾脏免受缺血造成的急性损伤，这些成的急性损伤，这些RNA成分中的成分中的miRNA有助于低氧环境下肾固有细胞启有助于低氧环境下肾固有细胞启动增殖程序。动增殖程序。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤4EPCl内皮祖细胞内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。动员到外周血参与损伤血管的修复。199

4、7年，年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞化为血管内皮细胞的前体细胞,并将其命名为血管内皮并将其命名为血管内皮祖细胞。近年来的研究显示祖细胞。近年来的研究显示,内皮祖细胞在心脑血管疾内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，并为缺血性疾病的研究治疗提供了均发挥重要作用，并为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路。新思路。EPCs生物学特性和治疗作用的研究成为这生物学特性和治疗作用的研究成为这一领域新的热点。一领域新的热点。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血

5、再灌注损伤5MVlMicrovesicle（MV）是机体内细胞在正常和）是机体内细胞在正常和病理状态下都会分泌的直径在病理状态下都会分泌的直径在301000nm 之之间的微小囊泡。多数研究者用间的微小囊泡。多数研究者用MV 来指代具有来指代具有细胞间信号传递功能的囊泡。细胞把特异的生细胞间信号传递功能的囊泡。细胞把特异的生物活性分子如蛋白质、物活性分子如蛋白质、miRNA 等包裹到等包裹到MV 中，被运输到相应的受体细胞并调节受体细胞中，被运输到相应的受体细胞并调节受体细胞的生物功能。的生物功能。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤6EPC来源的来源的MV一些基本特征一些基本特征内皮祖细胞微囊泡

6、肾脏缺血再灌注损伤7miRNAl微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)，是一类非编码的由 19-24个核苷酸组成的小分子单链RNA,它们能够与靶mRNA的碱基互补配对而起作用，使 mRNA降解或抑制其翻译，从而参与各种重要的生理和病理过程。miRNA可稳定存在于血清血浆等体液中，有可能作为一种新的生物标志物用于临床，有助诊断疾病或者判断疾病的预后和复发情况，指导用药和选择治疗方式。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤8miRNA的产生和转运机制的产生和转运机制miRNA的产生及其作用方式的产生及其作用方式视频视频内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤9实验目的实验目的l内皮祖细胞释放的微囊

7、泡对肾脏急性缺血再灌注损伤的动物模型是否有保护效应;l微囊泡对低氧诱导的肾脏上皮细胞和内皮细胞损伤的保护作用的机制研究内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤10实验材料及方法实验材料及方法lWistar 雄性大鼠lEPCs 和 fibroblast细胞lRNase;siRNA;anti-miR-126 antagomiRS;anti-miR-296 antagomiRS;anti-Dicer polyclonal antibody;内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤11实验分组实验分组实验分组normalshame operatedIRIIRI+MV EPCsIRI+MV EPCs RNaseIR

8、I+MV EPCssiRNA DicerIRI+MV EPCssiRNA controlIRI+MVAmiR 126/296IRI+MV fibroblast内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤12 Bioanalyzer RNA profileEPCEPC MV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤13miR-126 and miR-296 含量比较含量比较EPCEPC MVFIBROFIBRO MV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤14经过不同处理后经过不同处理后miR-126和和miR-296的含量的含量内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤15实验过程实验过程1、按照分组制作模型，立即尾静脉注射

9、MV。2、实验第二天，所有组，每组处死6只大鼠取样本分析。3、实验第七天，所有组，每组处死6只大鼠取样本分析。4、实验第180天，前四组，每组处死6只大鼠取样本分析。IRI模型模型：右肾切除+左肾肾蒂夹闭45min。MV经由尾静脉注射，30微克。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤16实验结果实验结果lEPC 来源的来源的MV 和成纤维细胞来源的和成纤维细胞来源的MV的特征及其比较的特征及其比较lEPC 来源的来源的MV对对 肾脏缺血再灌注损伤的保护作用肾脏缺血再灌注损伤的保护作用lEPC 来源的来源的MV对体外培养的低氧管周内皮细胞（对体外培养的低氧管周内皮细胞（TEnCs）和肾）和肾小管上皮

10、细胞小管上皮细胞(TEpCs)的影响的影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤17EPC 来源的来源的MV对对 肾脏缺血再灌注损伤的肾脏缺血再灌注损伤的保护作用保护作用 l血肌酐和尿素氮水平l病理学形态检查l细胞凋亡及增殖检测l长期的影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤18血清肌酐和尿素氮血清肌酐和尿素氮内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤19MV注射后在体内的分布情况注射后在体内的分布情况内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤20 病理检查病理检查内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤21 形态学评价形态学评价内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤22细胞增殖率检测（细胞增殖率检测（a、c Brdu；b、

11、d PCNA）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤23细胞凋亡检测（细胞凋亡检测（TUNEL法）法）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤24炎细胞浸润炎细胞浸润内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤25长期结果（六个月后）长期结果（六个月后）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤26l这些MV是 到血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的呢内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤28不同表面蛋白分子对不同表面蛋白分子对MV内化的影响内化的影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤29不同来源的不同来源的MV内化的区别内化的区别内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤30mv protein surface expressionEP

12、C-derived MVFibroblast-derived MV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤31protein surface expression的区别的区别内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤32EPC-derived MV 对低氧环境培育的对低氧环境培育的TEnCs细胞凋亡、血管生成的影响细胞凋亡、血管生成的影响lTUNEL法检测TEnDs凋亡l毛细血管样结构检测促血管生成作用内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤33EPC-derived MV 对低氧环境培育的对低氧环境培育的TEnCs促血管生成相关基因表达的影响促血管生成相关基因表达的影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤34EP

13、C-derived MV 对低氧环境培育的对低氧环境培育的TEpCs细胞凋亡影响细胞凋亡影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤35EPC-derived MV 对低氧环境培育的对低氧环境培育的TEpCs凋亡相关基因表达的影响凋亡相关基因表达的影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤36内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤37结论结论l注射含有miR126/296的MV的大鼠血肌酐和尿素氮水平明显降低；明显改善肾小球、肾小管和肾间质的形态学表现；能使小管坏死减少、管型生成减少；并且能够抑制细胞凋亡、促进细胞增殖；减少炎细胞浸润。长期结果是：血肌酐水平下降，间质纤维化减少和血管生成增多，无论是短期结果

14、还是长期结果，都显示出miRNA126/296对IRI模型的形态学和功能学的保护作用。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤38lL-selectin 是介导MV 内化的重要表面蛋白分子。l含有miR126/296的MV内化后，能够使凋亡相关基因表达下调，抑制上皮细胞和内皮细胞的凋亡，血管形成相关基因表达上调，促进血管形成，保护肾脏功能。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤39讨论讨论l在体内，微囊泡是如何进入肾小管上皮细胞的？l此实验中，成纤维细胞缺乏这种保护作用是由于缺少miR-126/296还是由于缺乏L-selectin造成的？（图）l生理状况下和病理状况下MV中生物活性分子的成分是否相同？内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤40请多批评指正请多批评指正内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤41