植物基因工程载体及其构建课件.ppt

1、第三章植物基因工程载体及其构建第一节第一节 载体概述载体概述1.1.载体概念载体概念载体载体(vector)(vector)：能够承载外源基因，并将其转入受体细胞能够承载外源基因，并将其转入受体细胞进行扩增和表达的进行扩增和表达的DNADNA分子分子。运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力和整合能力；为外源基因提供复制能力和整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；功能功能所以，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持所以，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，很大程度上取决于高效表达，很大

2、程度上取决于载体载体。具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的平安性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体的平安性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体大小：原那么上要求载体越小越好；载体大小：原那么上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。如果需要外源基因的表达：启动子。载体应具备的条件载体应具备的条件2.2.载体的种类载体

3、的种类按来源分：按来源分：细菌质粒载体细菌质粒载体病毒载体病毒载体噬菌体载体噬菌体载体转座子载体转座子载体Ti Ti 质粒质粒Ri Ri 质粒质粒人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等按功能分：按功能分：克隆载体：主要用来克隆和扩增克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。源基因在宿主细胞中复制扩增。表达载体：除具有克隆载体的根本元件外，还具有转表达载体：除具有克隆载体的根本元件外，还具有转录、翻译所必需的录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。中有效表达。整

4、合载体：将目的基因插入到受体染色体中。整合载体：将目的基因插入到受体染色体中。目的基因目的基因克隆载体克隆载体中间载体中间载体卸甲载体卸甲载体转化载体转化载体其功能是其功能是保存和克隆保存和克隆目的基因。与微生物基因工程目的基因。与微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的相似，通常是由多拷贝的E.ColiE.Coli小质粒为载体。小质粒为载体。切除致瘤基因的切除致瘤基因的TiTi质粒或质粒或RiRi质粒，是构质粒，是构建转化载体的建转化载体的受体质粒受体质粒。中间克隆载体中间克隆载体中间表达载体中间表达载体大肠杆菌质粒插入大肠杆菌质粒插入T-DNAT-DNA片段及目的基因、标片段及目的基因、标记基

5、因等。是构建中间表达载体的根底质粒。记基因等。是构建中间表达载体的根底质粒。含有植物特异启动子的中间载体。作为构建含有植物特异启动子的中间载体。作为构建转化载体的质粒。转化载体的质粒。最后用于目的基因导入植物细胞的载体，最后用于目的基因导入植物细胞的载体，工程载体工程载体。由中间表达载体和卸甲载体构建。由中间表达载体和卸甲载体构建。第二节第二节 质粒载体质粒载体质粒质粒(plasmid)(plasmid)：存在于细菌或真菌染色体外的小型环：存在于细菌或真菌染色体外的小型环状状(线型质粒线型质粒DNADNA分子分子线虫、衣藻等线虫、衣藻等)双链双链DNADNA分子分子(酵母的酵母的“杀伤质粒是杀

6、伤质粒是RNA)RNA)，可自身复制和表达。，可自身复制和表达。不是寄主生长所必需的，但可以赋不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力带有抗性基因等。影响的能力带有抗性基因等。分子量在分子量在1-200 kb1-200 kb之间。之间。1 1、质粒、质粒plasmidplasmid概念概念质粒空间构型质粒空间构型超螺旋：共价闭合环状超螺旋：共价闭合环状DNA开环开环DNA：1条链上有一至数个缺口条链上有一至数个缺口线型线型DNA：最快的是最快的是超螺旋超螺旋，其次是其次是线性线性DNADNA，最慢的是最慢的是开环开环DNADNA。2

7、2、质粒、质粒plasmidplasmid构象构象3 3、质粒的自主复制性、质粒的自主复制性严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmidstringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有1313份拷贝。份拷贝。松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有几十，有几十几百份拷贝。几百份拷贝。质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制质粒。复制系统进行自主复制质粒。DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞

8、中的分子数拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型：细胞中的分子数拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型：4 4、质粒的不相容性、质粒的不相容性同种的或亲缘关系相近的两种质粒，含有同种的或亲缘关系相近的两种质粒，含有相似复制子结构相似复制子结构，不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。不相容性的质粒组成不相容性群。容性。不相容性的质粒组成不相容性群。在第二个质粒导入后，在不涉及在第二个质粒导入后，在不涉及DNADNA限制系统时，不相容的质限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞粒一般为利用同一复制系统，质

9、粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。争，随机挑选，最终放大。5 5、质粒的可转移性、质粒的可转移性接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞接合作用。甚至能使寄主染色体上的基因随其一个细胞接合作用。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到受体菌种。道转移到受体菌种。非接合型质粒：不能再天然条件下独立地发生接合作用。非接合型质粒：不能再天然条件下独立地发生接合作用。某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助，也能发生某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助，也能发生DNA转移。由转移。由mob、tra基因顺式因子基因顺

10、式因子bom及其内部的转移缺及其内部的转移缺口位点口位点nic决定。决定。6 6、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记物质抗性物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱：抗生素、细菌毒素、有机碱对重组对重组DNA分子的分子的筛选筛选十分重要！十分重要！选择标记：选择标记：用于转化子的挑选；用于转化子的挑选；筛选标记：筛选标记：用于重组子的挑选；用于重组子的挑选；转化子：转化子：成功转化了载体的宿主细胞；成功转化了载体的宿主细胞；重组子：重组子：真正含有重组真正含有重组DNADNA的转化子。的转化子。按用途

11、可分为选择标记基因和筛选标记基因。按用途可分为选择标记基因和筛选标记基因。筛选标记基因筛选标记基因插入失活法插入失活法互补筛选法互补筛选法lacZlacZ编码编码-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可诱导其表达半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可诱导其表达 (乳糖既是诱导物乳糖既是诱导物,也是底物也是底物)；IPTGIPTG：乳糖衍生物，可作为：乳糖衍生物，可作为laclac操纵子的诱导物，但不能操纵子的诱导物，但不能作为反响底物；作为反响底物；X-galX-gal：可作：可作 lac lac操纵子的底物，不能作为诱导物。还可操纵子的底物，不能作为诱导物。还可作为生色剂，被作为生色剂，被-半乳糖苷酶分解后产生

12、兰色物质，使半乳糖苷酶分解后产生兰色物质，使菌落呈现兰色。菌落呈现兰色。laclac Z Z M15 M15 放在放在F F质粒上，随宿主传代；质粒上，随宿主传代；laclac Z Z 放在载体上，作为筛选标记；放在载体上，作为筛选标记；受体菌有受体菌有JMJM系列、系列、TG1TG1和和XL1-BlueXL1-Blue等。等。lac Zlac Z M15 M15：缺失：缺失-半乳糖苷酶第半乳糖苷酶第1111-4141个个aaaa；lac Zlac Z ：只编码：只编码N N端端140140个个aaaa；lac Zlac Z M15+M15+lac Zlac Z =功能互功能互补补在在lac

13、Zlac Z 编码区上游插入一小片段编码区上游插入一小片段DNA(DNA(如如51bp51bp的的MCS)MCS)，不影响不影响-半乳糖苷酶的功能互补。但在该小片段半乳糖苷酶的功能互补。但在该小片段DNADNA中再插中再插入一个片段，将导致产生无互补能力的入一个片段，将导致产生无互补能力的-半乳糖苷酶片段；半乳糖苷酶片段；7 7、天然质粒载体的局限性、天然质粒载体的局限性1 1分子量大，拷贝数低分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101pSC101，分子长，分子长 9.1 kb9.1 kb。但只有一个但只有一个EcoEcoR IR I切点充当克隆位点

14、，切点充当克隆位点，TetTetr r 作为筛选标志。作为筛选标志。2 2筛选标志不理想，适宜的单一酶切位点少筛选标志不理想，适宜的单一酶切位点少ColE1ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1E1colicin E1colicin E1。杀死不含杀死不含ColE1 ColE1 质粒的菌，形成质粒的菌，形成“噬菌斑。噬菌斑。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I EcoR I 正好位于这个基因的内部。正好位于这个基因的内部。改造策略：改造策略：去掉多余片段：缩小质粒分子量，提高外源去掉多余片段：缩小质粒分子量，提高外源DNA片段的装载量；片段的装载量；减少限制性

15、酶切位点：缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接减少限制性酶切位点：缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶酶.；提供多克隆位点提供多克隆位点易识别的选择标记：通过质粒之间的重组导入；易识别的选择标记：通过质粒之间的重组导入；平安性改造：质粒载体不能在细菌间随便转移；平安性改造：质粒载体不能在细菌间随便转移；增加辅助功能：表达载体。增加辅助功能：表达载体。8 8、常用的质粒载体、常用的质粒载体1 1pBR322pBR322质粒载体质粒载体F.BolivarF.Bolivar和和R.L.RodriguezR.L.Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。复制起点：复制起点：pMB1pMB1系列来

16、源于系列来源于ColE1ColE1的高拷贝型复制起点，的高拷贝型复制起点，高达高达1000-30001000-3000个拷贝；个拷贝；AmprAmpr基因：基因：pSP2124pSP2124质粒的质粒的AmprAmpr基因；基因；TetrTetr基因：基因：pSC101pSC101的的Tetr Tetr 基因；基因；长度：长度：4361 bp4361 bp；选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性；选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性；多克隆位点：多克隆位点：2424个克隆位点；个克隆位点；其中其中9 9个会导致个会导致TetrTetr基因失活如基因失活如BamH IBamH I、Hind Hind、Sa

17、l ISal I；3 3个会导致个会导致AmprAmpr基因失活基因失活Sca ISca I、PvuIPvuI、Pst IPst I。衍生质粒：衍生质粒：pBR325pBR325、pBR327pBR327及及pAT153pAT153等。等。2 2pUCpUC质粒载体质粒载体University of CaliforniaUniversity of California的的J.MessingJ.Messing和和J.VieriaJ.Vieria于于19781978年，在年，在pBR322pBR322的根底上改造而成。属正选择载体。的根底上改造而成。属正选择载体。复制起点：复制起点：pBR322p

18、BR322的的 orioriAmpAmpr r基因：基因：pBR322pBR322AmpAmpr r基因，不含原有酶切位点；基因，不含原有酶切位点；lacZlacZ启动子：大肠杆菌；启动子：大肠杆菌；lacZlacZ基因：大肠杆菌基因：大肠杆菌lacZlacZ的氨基酸片段；的氨基酸片段；长度：约长度：约2.7 kb2.7 kb；克隆位点：克隆位点：1010个连续的单一酶切位点，位于个连续的单一酶切位点，位于lacZlacZ基因基因55端。端。选择标记：选择标记：氨苄青霉素和蓝白斑筛选；氨苄青霉素和蓝白斑筛选；pUC7pUC7、pUC8pUC8、pUC9pUC9、pUC10pUC10、pUC11

19、pUC11、pUC18pUC18、pUC19pUC19更小的分子量；更小的分子量；选择方便：正向选择，可显色和抗菌素双重直接选择；选择方便：正向选择，可显色和抗菌素双重直接选择；克隆便利：具有多克隆位点，外源克隆便利：具有多克隆位点，外源DNADNA方便插入；方便插入；测序方便：测序方便：pUCpUC的的MCSMCS与与M13M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCSMCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNADNA转移到转移到M13M13载体上测序。载体上测序。3 3pGEMpGEM系列载系列载体体由由pUCpUC派生而来。与派生而来。与pUCpUC的主要区别是在的主要区别是在MCSMCS

20、的两侧分别加的两侧分别加了一个噬菌体启动子了一个噬菌体启动子T7T7和和SP6SP6。可对插入片段进行转录。可对插入片段进行转录。还参加了丝状噬菌体还参加了丝状噬菌体f1f1的复制起点。的复制起点。3 3pBluescript II KS(pBluescript II KS()系列载体系列载体在在MCSMCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7T7和和T3T3。可对插。可对插入片段进行转录。还参加了丝状噬菌体入片段进行转录。还参加了丝状噬菌体f1f1的复制起点。的复制起点。9 9、PCRPCR产物克隆载体产物克隆载体1 1T T载体载体PCRPCR产物产物往往在往往

21、在33端突出一个或多个端突出一个或多个A A，将将T-T-载体载体的的MCSMCS中部已经切开，各有一个中部已经切开，各有一个33端突出的端突出的T T。所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为T-AT-A克隆克隆。目前，目的基因的获得几乎都是用目前，目的基因的获得几乎都是用PCRPCR的方法，如何将的方法，如何将PCRPCR产物连接到载体上？产物连接到载体上？克隆载体线性化；克隆载体线性化；克隆载体末端补平；克隆载体末端补平；克隆载体末端加克隆载体末端加T T。商业化商业化T T载体载体 一般来说，商业化的一般来说，商业化的T T载体多是先使用平端限制性内

22、载体多是先使用平端限制性内切酶如切酶如EcoRVEcoRV将克隆载体进行线性化，然后再单独将克隆载体进行线性化，然后再单独参加参加dTTPdTTP和和TaqTaq酶酶72727575反响，进行末端的加反响，进行末端的加T T。自制自制T T载体载体 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个有单个T T末端突出的片段，最常用的内切酶为末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmIXcmI，其，其识别和切割特点如下：识别和切割特点如下：6、携带特殊的遗传标记T-DNA区(transferred DNA regions)VirD2及VirE2上有核定位

23、信号，但VirE2与VirD2相比，其核定位功能较弱。赋予寄主菌株对土壤杆菌素的反响性；具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒。2-3h，OD600=0.含有植物特异启动子的中间载体。Ti质粒的功能区域RecombinantsLOC_Os10g41770拷贝数多，有几十几百份拷贝。lacZ启动子：大肠杆菌；1T-DNA的加工及转移人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。TOPOTOPO技术技术拓扑异构酶拓扑异构酶

24、I I在位点在位点CCCTTCCCTT切断并松弛超螺旋切断并松弛超螺旋DNADNA，然后重，然后重新连接末端。这样，其同时作为新连接末端。这样，其同时作为限制酶限制酶和和连接酶连接酶。TOPOTOPO克隆是一种将拓扑异构酶克隆是一种将拓扑异构酶与与 T-T-载体相结合的载体相结合的 PCR PCR 产物产物快速克隆系统快速克隆系统 pCR-TOPO pCR-TOPO，无，无需需 DNA DNA 连接酶连接酶做连接。做连接。33末端的突出末端的突出 T T 上共价结合上共价结合了一个拓扑异构酶了一个拓扑异构酶 ，当，当带带 3 3 末端的突出末端的突出 A A 的的 PCR PCR 产物与该产物

25、与该 T T 载体互补配对时，载体互补配对时，拓扑异构酶拓扑异构酶 就将该缺口就将该缺口连接起来。连接起来。因为越来越多高确限度热稳定酶如因为越来越多高确限度热稳定酶如PfxPfx、PfuPfu被用于被用于PCRPCR扩扩增，使到增，使到PCRPCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。2 2平末端平末端PCRPCR产物载体产物载体TOPO-BluntTOPO-Blunt载体载体在在 lacZ lacZ基因的下游融合了一个基因的下游融合了一个 ccdB ccdB C

26、ontrol of cell Control of cell deathdeath基因，该基因对大肠杆菌是致死的。基因，该基因对大肠杆菌是致死的。载体切成线状，再与目标载体切成线状，再与目标 DNA DNA 连接，转化大肠杆菌。连接，转化大肠杆菌。外源外源 DNA DNA 片段与载体连接后，片段与载体连接后，ccdB ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。在大肠杆菌中存在下来。如果没有如果没有DNADNA片断插入，片断插入，ccdBccdB基因那么基因那么会表达，造成细菌染色体的降解导致会表达，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。细菌死亡

27、。TOPOTOPO克隆高效性原理克隆高效性原理TopoTopo连接反响有两个分子参与，而传统的连接反响有三个连接反响有两个分子参与，而传统的连接反响有三个分子参与，其热力学上的优势导致分子参与，其热力学上的优势导致5 5分钟的快速连接。分钟的快速连接。1010、质粒提取、质粒提取细菌培养和富集细菌培养和富集细胞悬浮细胞悬浮细胞破碎细胞破碎细胞碎片基因组去除细胞碎片基因组去除蛋白去除蛋白去除质粒收集质粒收集溶液溶液1 1：50 mM50 mM葡萄糖，葡萄糖，25 mM Tris-Cl25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0溶液溶液2 2：0.

28、2 N NaOH 0.2 N NaOH，1%SDS1%SDS；溶液溶液3 3：3 M 3 M 醋酸钾醋酸钾 ，2 M 2 M 醋酸醋酸苯酚、氯仿抽提苯酚、氯仿抽提异丙醇异丙醇/乙醇沉淀，乙醇沉淀，70%70%乙醇清洗乙醇清洗 具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；具备适宜的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的平安性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体的平安性：对受体细胞无毒害，

29、不能随便转移；载体大小：原那么上要求载体越小越好；载体大小：原那么上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。如果需要外源基因的表达：启动子。载体应具备的条件载体应具备的条件1111、大肠杆菌感受态制备及转化、大肠杆菌感受态制备及转化1 1热激法热激法挑选单菌落挑选单菌落过夜振荡培养过夜振荡培养取取1ml1ml菌液菌液+50ml+50ml培养基培养基2-3h2-3h，OD600=0.6OD600=0.6取取1ml1ml菌液菌液+50ml+50ml培养基培养基2-3h2-3h，OD600=0.6OD600=0.6低温低速离心收集细胞低温低速离心收集细胞0.1MCaCl0.1MCaCl2

30、2悬浮处理细胞悬浮处理细胞2ml0.1MCaCl2ml0.1MCaCl2 2悬浮细胞，悬浮细胞，分装，分装，-80-80保存。保存。感受态细胞制备感受态细胞制备转化转化取出感受态取出感受态冰浴解冻冰浴解冻参加连接产物参加连接产物/质粒质粒冰浴冰浴30 min30 min42热激热激90 S冰浴冰浴1 min1 min参加参加1 ml LB1 ml LB培养基培养培养基培养45 min45 min复苏复苏产物体系不超过产物体系不超过1/101/10收集菌体，涂板筛选，过夜培养收集菌体，涂板筛选，过夜培养2 2电击法电击法当细菌长到对数中期；当细菌长到对数中期；冷却，离心；冷却，离心；然后用冷却的

31、去离子水反复清洗；然后用冷却的去离子水反复清洗；最后用最后用10%甘油重悬；甘油重悬；超低温保存。超低温保存。感受态细胞制备感受态细胞制备转化转化受电场强度、电脉冲长度和受电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等参数浓度等参数的影响。的影响。电压和电脉冲长度增高，转化的细胞数量也电压和电脉冲长度增高，转化的细胞数量也有所提高，但存活率下降。有所提高，但存活率下降。电压：电压：2.5 kv，电阻：，电阻：300欧；欧；电容：电容：2.5 uF1212、大肠杆菌重组子筛选和检测、大肠杆菌重组子筛选和检测思考题思考题 BamH Xba EcoR IBamH IXba IPCRPCR检测正确，片段已经整合进

32、载体；检测正确，片段已经整合进载体；用用BamBamHH和和XbaXba切不出目的片段；切不出目的片段；载体酶切位点在大肠杆菌中被甲基化；载体酶切位点在大肠杆菌中被甲基化；载体构建过程中出现星活性；载体构建过程中出现星活性；第三节第三节 工程载体工程载体植物基因转化载体必须具备的功能植物基因转化载体必须具备的功能 能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中，并整能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中，并整合到宿主细胞的基因组合到宿主细胞的基因组DNADNA上；上；能提供被寄主细胞的复制和转录系统识别的能提供被寄主细胞的复制和转录系统识别的DNADNA序列，即启动子和复制子，以保证转化的外源基序列，即启

33、动子和复制子，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。因能在植物细胞中进行复制和表达。一、根瘤农杆菌一、根瘤农杆菌TiTi质粒载体质粒载体1 1、TiTi质粒的遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型TiTi质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状合的环状DNADNA分子，分子，约有约有200kb200kb组成。组成。v 章鱼碱型章鱼碱型 (octopine)(octopine)；v 胭脂碱型胭脂碱型 (nopaline)(nopaline)；v 农杆碱型农杆碱型 (agropine)(agropine)；v 农杆菌素碱型农杆

34、菌素碱型(agrocinoine)(agrocinoine)或称琥珀碱型。或称琥珀碱型。根据其诱导的植物冠瘿瘤中合成的冠瘿碱种类的不同，根据其诱导的植物冠瘿瘤中合成的冠瘿碱种类的不同，TiTi质质粒可分成粒可分成四种类型四种类型：Agrobacterium tumefaciens章鱼碱型章鱼碱型(octopine)2.Ti2.Ti质粒的功能区域质粒的功能区域 T-DNAT-DNA区区transferred-DNA regionstransferred-DNA regions：T-DNA T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从TiTi质粒上切割下来质粒上切割下来转移到植物

35、细胞的一段转移到植物细胞的一段DNADNA，称为转移，称为转移DNADNA。该。该DNADNA片段上的片段上的onconc基因与肿瘤的形成有关。基因与肿瘤的形成有关。VirVir区区virulence regionvirulence region 该区段上的基因能激活该区段上的基因能激活T-DNAT-DNA转移，使农杆菌表现出毒转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。性，故称之为毒区。T-DNAT-DNA区与区与VirVir区在质粒区在质粒DNADNA上彼此相邻，上彼此相邻，约占约占TiTi质粒质粒DNADNA的三分之一。的三分之一。ConCon区区regions encoding conju

36、gationsregions encoding conjugations 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因tratra，调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tratra基因，基因，诱导诱导TiTi质粒转移，因此称之为接合转移编码区。质粒转移，因此称之为接合转移编码区。OriOri区区origin of replicationorigin of replication 该区段基因调控该区段基因调控TiTi质粒的自我复制，故称之为复制起始质粒的自我复制，故称之为复制起始区。区。T-DNAT-DNA区

37、区 (transferred DNA regions)(transferred DNA regions)T-DNAT-DNA：农杆菌侵染植物时，从农杆菌侵染植物时，从TiTi质粒上导入植物细胞的一质粒上导入植物细胞的一段段DNADNA。23kb23kb左右，携带有致瘤基因和冠瘿碱合成酶基因；左右，携带有致瘤基因和冠瘿碱合成酶基因；T-DNAT-DNA区的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因。这些基区的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因。这些基因的表达，破坏了植物体内正常的激素平衡，导致植物冠因的表达，破坏了植物体内正常的激素平衡，导致植物冠瘿廇的出现；瘿廇的出现；T-DNAT-DNA两端各有一高

38、度同源的两端各有一高度同源的25bp25bp的重复序列，分别称为的重复序列，分别称为左左边界序列边界序列(LB)(LB)和和右边界序列右边界序列(RB)(RB)，对对T-DNAT-DNA转移到植物细转移到植物细胞至关重要胞至关重要 (尤其是尤其是RB)RB)。VirVir区的基因与区的基因与T-DNAT-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，能够使农杆菌表现出毒性；关，能够使农杆菌表现出毒性；VirVir区总长约区总长约35kb35kb，包括，包括7 7个基因，个基因，VirAVirA、VirBVirB、VirCVirC、VirDVirD、VirEVirE、

39、VirGVirG、VirHVirH；VirAVirA：组成性表达；组成性表达；VirBVirB、VirCVirC、VirDVirD、VirEVirE：诱导性表达：诱导性表达：VirGVirG：受信号分子诱导后表达量提高受信号分子诱导后表达量提高1010多倍；多倍；信号分子：信号分子：乙酰丁香酮乙酰丁香酮等。等。VirVir区区 (毒性区毒性区)植物细胞创伤信号植物细胞创伤信号ASAS结合并激活结合并激活VirAVirA，VirAVirA转转移磷酸基团激活移磷酸基团激活VirGVirG，形成二聚物，结合到，形成二聚物，结合到VirVir基因基因启动子区域，激活这些基因的表达。双因子调控体启动子区

40、域，激活这些基因的表达。双因子调控体系。系。毒性区对毒性区对T-DNAT-DNA的作用既可以顺式作用进行，也可以反式的作用既可以顺式作用进行，也可以反式作用进行。两种情况下作用进行。两种情况下T-DNAT-DNA都可在毒性区作用下转移并都可在毒性区作用下转移并整合到植物基因组中；整合到植物基因组中；v 顺式作用：顺式作用：指指T-DNAT-DNA区与毒性区位于同一个区与毒性区位于同一个TiTi质粒上；质粒上；v 反式作用：反式作用：指指T-DNAT-DNA与毒性区不在同一与毒性区不在同一TiTi质粒上，而位于质粒上，而位于另一个相应的中间载体质粒上。另一个相应的中间载体质粒上。调控调控TiTi

41、质粒的自我复制。质粒的自我复制。ConCon区区 (接合转移编码区接合转移编码区)具有在细菌间进行接合转移的有关基因具有在细菌间进行接合转移的有关基因(tratra)，调控，调控TiTi质质粒在农杆菌之间的转移。粒在农杆菌之间的转移。OriOri区区 (origin of replication)(origin of replication)细菌吸收和利用冠瘿碱的区域，具有冠瘿碱分解酶基因如细菌吸收和利用冠瘿碱的区域，具有冠瘿碱分解酶基因如章鱼碱分解酶基因章鱼碱分解酶基因OccOcc。冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区 (opine catabolism)(opine catabolism)4 4、Ti

42、Ti质粒基因转化机理质粒基因转化机理农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。1 1T-DNAT-DNA的加工及转移的加工及转移下链下链25bp25bp重复序列的右边界左起第重复序列的右边界左起第3 3和第和第4 4碱基间缺口剪切，碱基间缺口剪切，然后从缺口然后从缺口55端开始合成新的端开始合成新的DNADNA链，并一直延伸到左边链，并一直延伸到左边界第界第2222碱基处，置换出原来的下链，形成碱基处，置换出原来的下链，形成ssDNAssDNA，即，即T T链。链。VirD:VirD:包含包含VirD1VirD1、VirD2VirD2、VirD3Vir

43、D3、VirD4VirD4。VirD1VirD1具有拓扑异构酶活性，将超螺旋具有拓扑异构酶活性，将超螺旋DNADNA变为松弛变为松弛DNADNA；VirD2 VirD2具有核酸内切酶活性，切割双链具有核酸内切酶活性，切割双链DNADNA的一条链。的一条链。C C端有核定位信号。端有核定位信号。VirC:VirC:包含包含VirC1VirC1和和VirC2VirC2。为为ATPaseATPase，对质粒，对质粒DNADNA的准确剪切是必需的。的准确剪切是必需的。2 2T T链复合物的形成链复合物的形成T T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、

44、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜，才能整合进植物基因内。链必须防止被物细胞膜及核膜，才能整合进植物基因内。链必须防止被核酸降解，因此链可能以一种核酸降解，因此链可能以一种DNA-DNA-蛋白复合体形式存在。蛋白复合体形式存在。VirD2VirD2从从T-DNAT-DNA的产生到整合到植物基因组整个过程，都与的产生到整合到植物基因组整个过程，都与T-DNAT-DNA共价结合共价结合在一起。在一起。VirE2VirE2编码编码ssDNAssDNA结合蛋白结合蛋白,与任何与任何ssDNAssDNA结合。通达与链结合。通达与链非共非共价结合价结合，VirE2VirE2可包被可包被T T链链,形成细长的核形

45、成细长的核-蛋白丝蛋白丝,因而故因而故VirE2VirE2不仅不仅保护保护ssDNA,ssDNA,使使ssDNAssDNA抗抗33和和55外切核酸酶和内切核酸酶，外切核酸酶和内切核酸酶，而且而且T T使链形变成一种使链形变成一种可转运可转运的形式。的形式。3 3T T链复合物的转运链复合物的转运 形成跨膜孔道，需要形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜结合蛋白跨膜或者膜结合蛋白的参与；的参与；VirBVirB蛋白在膜上形成一种类似于细菌结合转移时从工体蛋白在膜上形成一种类似于细菌结合转移时从工体菌转至受体菌所必需的结构，即接合孔或性毛，菌转至受体菌所必需的结构，即接合孔或性毛，T-DNAT-DNA通过这

46、种孔由细菌进入到植物细胞。同时通过这种孔由细菌进入到植物细胞。同时VirBVirB也可能起也可能起运输和提供能量的作用。运输和提供能量的作用。4 4T T链复合体靶向植物细胞核链复合体靶向植物细胞核 VirD2 VirD2及及VirE2VirE2上有核定位信号，但上有核定位信号，但VirE2VirE2与与VirD2VirD2相比，相比，其核定位功能较弱。其核定位功能较弱。VirD2VirD2可能以一种极性方向，首先可能以一种极性方向，首先将将T T复合体定向至核孔，而复合体定向至核孔，而virE2virE2那么作为一种促进因那么作为一种促进因子，保证很长的子，保证很长的T T复合体在进入核孔时

47、不受干扰。复合体在进入核孔时不受干扰。VirD2VirD2及及VirE2VirE2蛋白上的核定位信号与动物相似，说明蛋白上的核定位信号与动物相似，说明植物和动物的这种信号从进化上讲是保守的。植物和动物的这种信号从进化上讲是保守的。5 5T T链整合到基因组链整合到基因组T-DNAT-DNA在植物染色体中的插入是随机的。它可插入任何一条在植物染色体中的插入是随机的。它可插入任何一条植物染色体。但植物染色体。但插入位点常有以下特点插入位点常有以下特点：T-DNAT-DNA优先整合到转录活泼的植物基因位点；优先整合到转录活泼的植物基因位点；T-DNAT-DNA与植物与植物DNADNA连接处富含连接处

48、富含A A，T T碱基对；碱基对；植物植物DNADNA上的插入靶位点与上的插入靶位点与T-DNAT-DNA边界序列有一定程度的同源边界序列有一定程度的同源性。性。由于这种同源性才使得插入的由于这种同源性才使得插入的T-DNAT-DNA和靶序列能互相靠近，并和靶序列能互相靠近，并有效地发生有效地发生DNADNA链的交换。链的交换。T-DNAT-DNA的整合是异常重组的结果。的整合是异常重组的结果。T-DNAT-DNA右未端在靶序列的识别及连接中是必需的，右未端在靶序列的识别及连接中是必需的，T-DNAT-DNA左未左未端和两个靶端和两个靶DNADNA未端那么参与局部配对和未端那么参与局部配对和D

49、NADNA修复。修复。T-DNAT-DNA插入的遗传特性：插入的遗传特性：T-DNAT-DNA的插入不引起植物的插入不引起植物DNADNA大的重排。但多数插入会导大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至致靶位点处小的缺失，缺失多至7979个核苷酸。个核苷酸。另一个常见的结果是，在另一个常见的结果是，在T-DNAT-DNA植物植物DNADNA连接处，会有连接处，会有几个至几个至3333个核苷酸的个核苷酸的“填充填充DNADNAFiller DNAFiller DNA存在，存在，这些这些“填充填充DNADNA的序列与靠近连接处的植物的序列与靠近连接处的植物DNADNA序列相序列相似。似

50、。在植物靶位处不要求有特异的序列，但假设在在植物靶位处不要求有特异的序列，但假设在T-DNAT-DNA两端两端和植物靶位处之间有一段短序列和植物靶位处之间有一段短序列5 510b10b同源，那么同源，那么可以在整合中起作用。可以在整合中起作用。4 4、TiTi质粒的生物学功能质粒的生物学功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；为寄主细胞合成植物激素为寄主细胞合成植物激素IAAIAA和细胞分裂素；和细胞分裂素；诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分；和冠瘿碱成分；赋予寄主菌株分解代谢各种冠