五章-酶学诊断课件.ppt

1、第五章第五章 诊断酶学诊断酶学Diagnostic Enzymology 目的：目的：学习并掌握血清酶的基本知识及其在学习并掌握血清酶的基本知识及其在临床检验诊断中的应用。临床检验诊断中的应用。学习内容：学习内容：第一节第一节 概述概述第二节第二节 酶测定技术酶测定技术第三节第三节 常用酶及同工酶测定的临床应用常用酶及同工酶测定的临床应用第一节第一节 概概 述述与酶催化反应有关的名词与酶催化反应有关的名词 酶促反应：酶促反应：酶催化的反应；酶催化的反应；酶活性酶活性(activity)(activity)：酶催化反应的能力；酶催化反应的能力；底物底物(substrate(substrate，S

2、)S)：酶所作用的物质；酶所作用的物质；产物产物(product(product，P)P)：酶促反应的生成物；酶促反应的生成物；酶的激活剂酶的激活剂(activator(activator）：）：加速酶促反应加速酶促反应 的物质；的物质；酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor(inhibitor）：）：减慢或终止酶减慢或终止酶 促反应的物质促反应的物质(一一)酶的组成、结构与功能酶的组成、结构与功能n组成组成单纯酶单纯酶(simple enzyme)(simple enzyme)：仅由氨基酸残基构成的酶仅由氨基酸残基构成的酶 结合酶（结合酶（conjugated enzyme)conjuga

3、ted enzyme)：由蛋白质部分和非蛋白质部分（辅由蛋白质部分和非蛋白质部分（辅助因子）构成的酶。助因子）构成的酶。结构结构*单体酶：单体酶：具有一、二、三级结构具有一、二、三级结构*寡聚酶：寡聚酶：具有一、二、三、四级结构具有一、二、三、四级结构每一种酶分子内具有与催化功能密切相关的空间结每一种酶分子内具有与催化功能密切相关的空间结构区域构区域-活性中心（活性中心（active centeractive center）底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 目目 录录酶的功能及其特性酶的功能及其特性功能：功能：对生物体内

4、的化学反应起催化作用。对生物体内的化学反应起催化作用。酶催化作用的特性：酶催化作用的特性：高度催化效率、高度特异性及高度可调高度催化效率、高度特异性及高度可调 节性。节性。（二）酶（二）酶的催化作用机制的催化作用机制酶底物复合物酶底物复合物 E+S E+P ES*诱导契合假说诱导契合假说(induced-fit hypothesis)酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶程称为酶-底物结合的诱导契合假说底物结合的诱导契合假说【酶促反应动力学酶促反应动力学】q概念概念 研究各

5、种因素对研究各种因素对酶促反应速度酶促反应速度影响的学科影响的学科-酶促反应动力学。酶促反应动力学。酶促反应速度：酶促反应速度：用单位时间内底物的消耗量用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量表示或产物的生成量表示V=VmaxS/Km+S米米-曼氏方程（曼氏方程（michaelis menten equation)【KmKm】KmKm的定义的定义由米由米-曼氏方程可以导出曼氏方程可以导出：（Vmax-v）SKm=v当当v=1/2Vmaxv=1/2Vmax时，时，Km=Km=S S。因此。因此KmKm值为反应速度值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。相当于最大反应速度一半时的底物浓度。K

6、mKm值是酶的值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。特征常数，具有重要的应用价值。大多数酶大多数酶KmKm在在10-610-2mmol/L10-610-2mmol/L之间之间Km值的应用值的应用1.1.反映酶与底物的亲合力反映酶与底物的亲合力 KmKm值越大，酶与底物亲合力越小，值越大，酶与底物亲合力越小，KmKm值越小，酶与底物亲合力越大。值越小，酶与底物亲合力越大。2.2.选择酶的最适底物选择酶的最适底物 KmKm值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的不同底物有不同的KmKm值值,Km,Km值最小的底物为酶的最适值最小的底物为酶

7、的最适底物。底物。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。促反应容易进行，并节省底物用量。3.3.计算不同底物浓度时酶促反应速度和相当于最计算不同底物浓度时酶促反应速度和相当于最大反应速度的比率大反应速度的比率 根据米根据米-曼氏方程可以计算曼氏方程可以计算 4.4.设计适宜的底物浓度，可通过米设计适宜的底物浓度，可通过米-曼氏方程曼氏方程来推算工具酶的用量。来推算工具酶的用量。酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的代表酶活性，一般要求初

8、速度达到最大速度的90%90%95%95%、底物消耗率为、底物消耗率为1%1%5%5%。这样既可以近似。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。费。5.鉴定酶的种类鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种类的酶其不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。值加以鉴定。某些酶的某些酶的KmKm值值 酶

9、酶 底物底物 Km(mmol/L)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 0.017己糖激酶己糖激酶 D-葡萄糖葡萄糖 0.05 D-果糖果糖 1.5-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 D-乳糖乳糖 4.0碳酸酐酶碳酸酐酶 H2CO3 9.0过氧化氢酶过氧化氢酶 H2O2 25蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖蔗糖 28糜蛋白酶糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸 1086.6.分别测定正逆方向反应的分别测定正逆方向反应的KmKm值及底物浓值及底物浓度，可推断该酶在体内的反应方向和催化度，可推断该酶在体内的反应方向和催化效率。效率。7.7.根据根据KmKm值可帮助寻找酶反应体系的限速值可帮助寻找酶反应体系的限速酶。

10、酶。酶反应体系中，酶反应体系中，KmKm大的酶可能为限速酶。大的酶可能为限速酶。【酶酶促反应促反应进程进程】酶活性浓度即酶的催化活性浓度，用酶促反酶活性浓度即酶的催化活性浓度，用酶促反应速度表示，指在规定条件下单位时间内底物的应速度表示，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。减少量或产物的生成量。v=-dS/dt 或或 v=dP/dt。底物浓度为底物浓度为S S,产物浓度为产物浓度为P P,时间为时间为t t，反应速度为，反应速度为v v注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。生成量为好。酶促反应中基质酶

11、促反应中基质SS、产物、产物PP和反应速率和反应速率V V在不同在不同时间变化的模式图时间变化的模式图n酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v)(v)达到最大速度达到最大速度VmaxVmax，即在过量底物存在，即在过量底物存在下的零级反应期的速度。下的零级反应期的速度。【酶酶促反应的影响因素和反应条件的促反应的影响因素和反应条件的选择选择】影响酶促反应的因素影响酶促反应的因素：酶浓度酶浓度底物浓度底物浓度pHpH温度温度电解质电解质辅酶辅酶激活剂激活剂抑制剂抑制剂酶促反应的最适条件：酶促反应的最适条件：我国检验学会文件提出的最适条件为我国检验学会文件提

12、出的最适条件为1.1.选合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的选合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度。种类和浓度。2.2.指示酶和辅助酶的种类和浓度。指示酶和辅助酶的种类和浓度。3.3.反应混合液的最适反应混合液的最适pHpH，缓冲液种类和浓度。，缓冲液种类和浓度。其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。4.4.在某些情况下，为了获得更好的测定重复性在某些情况下，为了获得更好的测定重复性或更大的临床价值，可考虑对上述或更大的临床价值，可考虑对上述“最适条最适条件件”作适度的修改。作适度的修改。(三三)酶的命名酶的命名1.1.习惯命名法：习惯命名法

13、：根据酶所催化的底物、反应根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源等进行命名。的性质以及酶的来源等进行命名。2.2.系统命名法：系统命名法：规定每一种酶均有一个系统规定每一种酶均有一个系统名称，它标明酶的底物与反应性质，底物名称，它标明酶的底物与反应性质，底物之间以之间以“：”分隔开。分隔开。3.3.应用：应用：为应用方便，对每一个酶同时推荐为应用方便，对每一个酶同时推荐一个习惯命名。一个习惯命名。(四四)酶的分类与编号酶的分类与编号 氧化还原酶类（氧化还原酶类（oxidoreductasesoxidoreductases）转移酶类（转移酶类（transfereasestransfereas

14、es）水解酶类（水解酶类（hydrolaseshydrolases）裂解酶类（裂解酶类（lyaseslyases）异构酶类（异构酶类（isomerasesisomerases）合成酶类（合成酶类（synthetasesynthetase）临床常用酶的名称与编号临床常用酶的名称与编号习惯用名习惯用名英文缩写英文缩写EC 编号编号系统名系统名乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LD(LDH)1.1.1.27L乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶ICD(ICDH)1.1.1.42异柠檬酸异柠檬酸:NADP+氧化还原酶氧化还原酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD(G6PDH)

15、1.1.1.49葡萄糖葡萄糖-6-磷酸：磷酸：NADP+氧化还原酶氧化还原酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶GLD(GLDH)1.4.1.3L谷氨酸：谷氨酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶单胺氧化酶单胺氧化酶MAO1.4.3.4单胺：单胺：氧化还原酶氧化还原酶-谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶-GT/GGT/GGTP2.3.2.2-谷氨酰肽：氨基酸谷氨酰肽：氨基酸-谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶GP2.4.1.11,4-D葡聚糖：磷酸葡聚糖：磷酸-D-葡萄糖基转移酶葡萄糖基转移酶谷胱甘肽转移酶谷胱甘肽转移酶GST2.5.1.18RX:谷胱甘肽谷胱甘肽R-转移酶转移酶门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨

16、基转移酶AST2.6.1.1L(天天)门冬氨酸：门冬氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶ALT2.6.1.2L丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶肌酸激酶肌酸激酶CK2.7.3.2三磷酸腺苷：肌酸转磷酸酶三磷酸腺苷：肌酸转磷酸酶脂肪酶脂肪酶LPS(LIP)3.1.1.3甘油三酯酰基水解酶甘油三酯酰基水解酶胆碱酯酶胆碱酯酶ChE3.1.1.8酰基胆碱酰基水解酶酰基胆碱酰基水解酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALP(AKP)3.1.3.1正磷酸单酯磷酸水解酶正磷酸单酯磷酸水解酶酸性磷酸酶酸性磷酸酶ACP3.1.3.2正磷酸单酯磷酸水解酶正磷酸单酯磷酸

17、水解酶5-核苷酸酶核苷酸酶5-NT3.1.3.55-核糖核苷酸磷酸水解酶核糖核苷酸磷酸水解酶-淀粉酶淀粉酶AMY(AMS)3.2.1.11,4-糖苷糖苷水解酶糖苷糖苷水解酶二、同二、同工酶及亚型的测定工酶及亚型的测定（一）同（一）同工酶的概工酶的概念与特征念与特征同工酶（同工酶（isoenzymeisoenzyme）是催化相同的化学是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质和反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质和免疫性能都存在差异的一组酶。免疫性能都存在差异的一组酶。1959年年Markert首次用电泳分离法发现动物首次用电泳分离法发现动物的乳酸脱氢酶具有多种分子形式，并将其称的乳酸脱氢

18、酶具有多种分子形式，并将其称为同工酶。为同工酶。（二）同工酶的分类与命名（二）同工酶的分类与命名按基因分类法：按基因分类法：单基因决定的同工酶、等单基因决定的同工酶、等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶。的同工酶。常用的分类方法是按组织来源分类。常用的分类方法是按组织来源分类。同工酶不仅存在于同一个个体的不同组织中，同工酶不仅存在于同一个个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构甚至同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中。中。人体重要的同工酶酶 同工酶种类 相关疾病 CK CK-BB CK-MB CK-MM 心肌梗死、肌病、颅脑损伤

19、、肿瘤 LD LD1、LD2、LD3、LD4、LD5 心肌梗死、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 ALP 肝、小肠、骨、胎盘、肾 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤 ACP 红细胞、前列腺、溶酶体 前列腺癌、血液病、骨肿瘤-GT-GT1-GT2-GT3-GT4 肝癌、梗阻性黄疸 AMY P-AMY、S-AMY 急慢性胰腺炎、腮腺炎 ALT ALTs、ALTm 心肌梗死、肝病 AST ASTs、ASTm 心肌梗死、肝病 检测同工酶及其亚型的临床意义检测同工酶及其亚型的临床意义 1.1.测定某一种或几种酶诊断疾病测定某一种或几种酶诊断疾病2.2.组织分布、细胞内定位、发生发育方面组织分布、细胞内定位、发生

20、发育方面都可能有所差异，可增加诊断的特异性都可能有所差异，可增加诊断的特异性.例：例：CKCK，大量存在于三种肌肉组织中，单，大量存在于三种肌肉组织中，单独总独总CKCK升高很难判断；骨骼肌升高很难判断；骨骼肌CK-MMCK-MM，平滑，平滑肌肌CK-BBCK-BB，心肌，心肌CK-MBCK-MB*。三、三、工具酶工具酶临床诊断工具酶：酶学分析作为试剂用于测临床诊断工具酶：酶学分析作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶定化合物浓度或酶活性的酶最常用工具酶：最常用工具酶：1.1.氧化酶系统（偶联氧化酶系统（偶联H2O2H2O2的工具酶）的工具酶）2.2.脱氢酶系统脱氢酶系统氧化酶系统氧化酶系统原

21、理原理待检物质在相应的氧化酶的催化下，生成待检物质在相应的氧化酶的催化下，生成H H2 2O O2 2。H H2 2O O2 2在以氢为受体的指示酶参与的指示反应中生成在以氢为受体的指示酶参与的指示反应中生成有色物质有色物质应用应用广泛用于血清中葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、广泛用于血清中葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等化合物浓度项目的测定甘油三酯等化合物浓度项目的测定脱氢酶系统脱氢酶系统 利用氧化利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)H的正的正/逆反应后，通过分光光度法或其他方逆反应后，通过分光光度法或其他方法直接测定法直

22、接测定NAD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。（二）酶（二）酶循循环法环法 （enzymatic cycling methodsenzymatic cycling methods）是采用两种工具酶进行的循环反映，使被检物信是采用两种工具酶进行的循环反映，使被检物信号放大扩增，从而提高检测灵敏度的酶学方法，号放大扩增，从而提高检测灵敏度的酶学方法，可用于检测微量的标本可用于检测微量的标本6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖+NADP+6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+CO2+NADPH6PGD谷氨酸谷氨酸+NADP+NH3+-酮戊二酸酮戊二酸+NADPHGLDH酶循环法原理：酶循环法原理：物质物质A A

23、 在酶在酶a(Ea)a(Ea)和底物和底物a(Sa)a(Sa)的存在下转化为的存在下转化为物质物质B,B,同时生成产物同时生成产物a(Pa);a(Pa);物质物质B B 又在酶又在酶b(Ebb(Eb)和底物和底物b(b(SbSb)的存在下转化为物质的存在下转化为物质A,A,同时生成产同时生成产物物b(b(PbPb)。上述反应每循环一次。上述反应每循环一次,将消耗与物质将消耗与物质A A 等量的等量的Sa Sa 和和SbSb,同时生成等当量的同时生成等当量的Pa Pa 和和PbPb。因此。因此在一定时间内在一定时间内,循环反应的次数亦就是循环反应的次数亦就是Sa Sa 和和SbSb 消消耗或耗或

24、Pa Pa 和和PbPb 生成相当于物质生成相当于物质A(A(或物质或物质B)B)的倍数的倍数,通过检测通过检测Sa Sa 或或SbSb 的减少或的减少或Pa Pa 或或PbPb 的生成就可以的生成就可以提高检测物质提高检测物质A(A(或物质或物质B)B)的的n n 倍灵敏度倍灵敏度.酶循环法测定血总胆汁酸酶循环法测定血总胆汁酸固固相酶（相酶（immobilized enzymesimmobilized enzymes）固相酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之固相酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。物理法：物理

25、法：吸附法、包埋法吸附法、包埋法化学法：化学法：共价偶联法、交联法共价偶联法、交联法优点优点:仍具高效催化性和高度专一性；提高了酶对仍具高效催化性和高度专一性；提高了酶对酸碱和温度改变的承受能力；反应后易与反应产物酸碱和温度改变的承受能力；反应后易与反应产物分离分离固相酶和离子敏感型电极组成的生物传感器，可用固相酶和离子敏感型电极组成的生物传感器，可用于测定由酶催化的反应底物于测定由酶催化的反应底物（三）代谢物浓度的酶法测（三）代谢物浓度的酶法测定技术定技术1.终终点法点法直接法直接法酶偶联法酶偶联法2.动动力学法力学法第二节第二节 酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术一、酶活一、酶活性测

26、定性测定根据测定方法分类：根据测定方法分类：量气法、分光光度法（最常用）、荧光量气法、分光光度法（最常用）、荧光法、放射核素法、电极法和其它方法。法、放射核素法、电极法和其它方法。根据对酶促反应时间的选择不同分类：根据对酶促反应时间的选择不同分类：定时法定时法连续监测法连续监测法（一）定（一）定时法时法n定义定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。少量或产物的增加量。n特点：特点：优点是简单优点是简单。缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线 性期。性期。n注意：固定时间法时间段的预定不宜太长

27、，一般注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以以30306060分钟为宜。分钟为宜。（二）连（二）连续监测法续监测法n定义：定义：测定底物或产物随时间的变化量，测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。又称为速率法。n原理：原理：该方法每隔一定时间（该方法每隔一定时间（10s10s60s60s）测定）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。曲线。优点优点:能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试

28、剂用量少，应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。可在较短时间内完成测定。缺点：缺点：要求高，要求能够精确地控制温度、要求高，要求能够精确地控制温度、pHpH值和底值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。要求。1.1.直直接连续监测法：接连续监测法：特点：特点：使用各种分析手段，在不停止酶反应使用各种分析手段，在不停止酶反应条件下直接测反应体系中底物或产物的变条件下直接测反应体系中底物或产物的变化，从而计算出酶活性浓度。

29、化，从而计算出酶活性浓度。v应用最多的方法为应用最多的方法为分光光度法分光光度法。v应用最广的反应系统应用最广的反应系统 NAD(P)HNAD(P)H，可以测定大部分的脱氢酶，可以测定大部分的脱氢酶，色素原底物，色素原底物，其本身为无色或微黄色，其本身为无色或微黄色，在酶作用下生成有色化合物，适用于测在酶作用下生成有色化合物，适用于测定水解酶和一些转移酶。定水解酶和一些转移酶。适用范围：当底物与产物之间，在光学性适用范围：当底物与产物之间，在光学性质或其它理化性质有显著差异时。质或其它理化性质有显著差异时。NAD+（NADP+）和）和NADH（NADPH）相互转变）相互转变2.2.间接连续监测

30、间接连续监测法法适用范围：适用范围：当底物与产物之间，在光学当底物与产物之间，在光学性质或其它理化性质无显著差异时。性质或其它理化性质无显著差异时。特点：特点：在反应系统中加入与酶反应无关的在反应系统中加入与酶反应无关的试剂，使底物和产物在光学性质上区别。试剂，使底物和产物在光学性质上区别。最常用间接法：最常用间接法：酶偶联法酶偶联法在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应与被测酶反应偶联。的酶促反应与被测酶反应偶联。（1 1）最简单的模式为：）最简单的模式为：Ex Ex 为待测酶，为待测酶，A A为底物，为底物，B B为中间产物。为中间产物。A

31、A、B B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶个酶EiEi（为指示酶），其底物为（为指示酶），其底物为B B，反应产物为，反应产物为P P可直接测定。可直接测定。PBAEiEx （2 2）如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其）如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：助反应。模式为：其中，其中，B B、C C均为中间产物，均为中间产物，EaEa、EiEi都为工具酶。都

32、为工具酶。最后一个酶称指示酶最后一个酶称指示酶EiEi，其他外加的酶都为辅助，其他外加的酶都为辅助酶（酶（EaEa）。）。最常用的指示酶：脱氢酶最常用的指示酶：脱氢酶 监测其反应物监测其反应物NAD(P)H在在340nm吸光度变化。吸光度变化。PCBAEiEaEx 酶酶偶联反应原理偶联反应原理（1 1）预孵育期：只存在底物）预孵育期：只存在底物A A，不存在指示酶反，不存在指示酶反应。应。（2 2）延滞期：反应启动一段时间，产物）延滞期：反应启动一段时间，产物B B开始出开始出现并逐渐增加，指示酶反应速度也较低。现并逐渐增加，指示酶反应速度也较低。（3 3）线性反应期（稳态期）：）线性反应期（

33、稳态期）：ExEx和和EiEi反应速率相反应速率相同。同。（4 4）非线性反应期：底物消耗，反应速度减慢。）非线性反应期：底物消耗，反应速度减慢。酶偶联法测定酶偶联法测定ALTALT的吸光度变化图的吸光度变化图 对对酶偶联反应的要求酶偶联反应的要求n指示酶反应必须是一级反应，酶反应速度与指示指示酶反应必须是一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相酶底物浓度相关。关。n指示酶、辅助酶催化的最大反应速度必指示酶、辅助酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，

34、反应体并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。差。n指示酶和辅助酶的选择指示酶和辅助酶的选择 高特异性的酶，尤其是指高特异性的酶，尤其是指示酶。示酶。辅助酶的数量较小，减少辅助酶就可以缩短辅助酶的数量较小，减少辅助酶就可以缩短延延滞期。滞期。酶偶联反应的合理性，尽量减少辅酶偶联反应的合理性，尽量减少辅助酶。助酶。应尽量选择应尽量选择Km值小的酶，以缩短延滞期值小的酶，以缩短延滞期 指示酶、辅助酶的最适条件尽量与测定酶指示酶、辅助酶的最适条件尽量与测定酶接接近。近。（三）干扰因素（三）干扰因素1.1.其他酶和物质的干扰其他酶和物质

35、的干扰2.2.酶的污染酶的污染3.3.非酶反应非酶反应4.4.分析容器的污染分析容器的污染5.5.沉淀形成沉淀形成（四）血（四）血清酶活性浓度测定条件的优化清酶活性浓度测定条件的优化 1 1方法条件的选择方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；尽可能采用连续监测法；减少操作步骤；化学试剂须具有一定纯度，不含减少操作步骤；化学试剂须具有一定纯度，不含影响反应速度的杂质；试验用水最好是纯水或双影响反应速度的杂质；试验用水最好是纯水或双蒸水；建议使用液体双试剂。蒸水；建议使用液体双试剂。2 2测定参数的设置测定参数的设置 内容包括：方法类型、波内容包括：方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、反应时

36、间、孵长、样品量与试剂量、稀释水量、反应时间、孵育时间、延迟时间、监测时间、试剂吸光度上、育时间、延迟时间、监测时间、试剂吸光度上、下限、底物耗尽限额、试剂空白速率、线性范围下限、底物耗尽限额、试剂空白速率、线性范围及计算因子及计算因子F F值。值。3 3仪器和设备仪器和设备 推荐使用半自动、全自动生化分析仪及配套设施。推荐使用半自动、全自动生化分析仪及配套设施。4 4试剂试剂 化学试剂必须具有一定的纯度，试验用水最后是化学试剂必须具有一定的纯度，试验用水最后是 纯水或双蒸水。纯水或双蒸水。（五）部分分析前因素对酶活性测定的干扰（五）部分分析前因素对酶活性测定的干扰1.溶血溶血2.抗凝剂抗凝剂

37、3.标本储存温度标本储存温度（六）酶（六）酶活性浓度的单位活性浓度的单位1.酶酶活性单位活性单位惯惯用单位用单位 酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。国国际单位（际单位（international unitinternational unit，IUIU）在特定的条件下，在特定的条件下，1 1分钟使底物转化分钟使底物转化1 1 molmol的酶量为一个国际单位。的酶量为一个国际单位。以以IUIU表示，表示，1IU=11IU=1 mol.minmol.min-1-1。

38、KatalKatal单位单位 在规定条件下，每秒钟转化在规定条件下，每秒钟转化1mol1mol底物的酶量底物的酶量为为1kat1kat，1kat=1mol.s1kat=1mol.s-1-1。常用单位为。常用单位为 katalkatal或或 nkatalnkatal。n Kat Kat与与IUIU的换算关系为：的换算关系为：1IU=11IU=1 molminmolmin-1-1=16.67nmols=16.67nmols-1-1=16.67nkatal=16.67nkatal2.酶酶活性浓度单位活性浓度单位临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活性单

39、位数表示，的酶活性单位数表示，U/L。连续监测法根据连续监测法根据摩尔消光系数摩尔消光系数进行酶活性浓度进行酶活性浓度的计算，公式如下：的计算，公式如下：LvVALU610min/3.3.参参考值和正常上限倍数的应用考值和正常上限倍数的应用参考区间参考区间不同的实验室由于条件各不相同有不同的参考值，不同的实验室由于条件各不相同有不同的参考值，对于仪器、试剂盒提供的信息都应经过实际验证对于仪器、试剂盒提供的信息都应经过实际验证和统计学处理，以决定是否采用和统计学处理，以决定是否采用正常上限倍数正常上限倍数是把酶测定值转换为正常上限值的倍数，其意义是把酶测定值转换为正常上限值的倍数，其意义在于可将

40、不同方法、不同单位，测定值、参考值在于可将不同方法、不同单位，测定值、参考值均不一致的结果进行比较均不一致的结果进行比较酶的异常以增加较为多见，因此不能以正常下限值酶的异常以增加较为多见，因此不能以正常下限值作为倍数指数作为倍数指数(七七)系系数数K K值的计算及应用值的计算及应用 K称为酶活性浓度定量系数称为酶活性浓度定量系数用于临床酶活性测定的计算与校正。用于临床酶活性测定的计算与校正。如如LD活性浓度，已知活性浓度，已知NADH的的 为为6.22 103cm-1.mol-1，血清量为，血清量为50 l，底物液为，底物液为1ml，比色杯光，比色杯光径为径为1cm，则，则 K=1.05 10

41、6/6.22 103 0.05 1=3376K值高，线性范围宽，重复性差；精密度好，值高，线性范围宽，重复性差；精密度好，K值低，值低，线性范围窄。线性范围窄。因此，因此，K值设置时应考虑测定酶的参考上限值和测值设置时应考虑测定酶的参考上限值和测定时间定时间对于一些参考值较低的酶，可延长测定时间，对于一些参考值较低的酶，可延长测定时间，K值值可设置大一些，最简单的方法是增加稀释倍数。可设置大一些，最简单的方法是增加稀释倍数。在实际工作中，结果会在实际工作中，结果会 受到仪器诸多因素的影响，受到仪器诸多因素的影响，应定期检查和实际测定指示酶的应定期检查和实际测定指示酶的 和系数和系数K（即仪（即

42、仪器实测器实测K值）值）（八）临（八）临床酶学测定的标准化床酶学测定的标准化 自学自学二、酶质量测二、酶质量测定定 1、免疫化学法测定酶质量的原、免疫化学法测定酶质量的原理理根据抗原抗体反应的原理，利用免疫化学技术，根据抗原抗体反应的原理，利用免疫化学技术，对一些不易测定或测定条件不易掌握的酶进行测对一些不易测定或测定条件不易掌握的酶进行测定，可以提高检验的灵敏度定，可以提高检验的灵敏度可以测定酶的活性和质量可以测定酶的活性和质量2 2、测、测定方法定方法 放射免疫测定（放射免疫测定（RIARIA）、免疫抑制法、化学发光）、免疫抑制法、化学发光免疫测定（免疫测定（CLIACLIA）、酶免疫测定

43、（）、酶免疫测定（EIAEIA）、荧光）、荧光酶免疫测定（酶免疫测定（FEIAFEIA）。）。3 3、结、结果报告方式果报告方式 （1 1）用酶活性浓度单位，结果以）用酶活性浓度单位，结果以U/LU/L表示。表示。（2 2）用质量浓度单位，结果直接用）用质量浓度单位，结果直接用ng/mlng/ml或或 g/Lg/L表示。表示。4 4、血、血清酶活性与酶质量的变化的关系清酶活性与酶质量的变化的关系5 5、免疫化学测定法的优点：免疫化学测定法的优点：灵敏度高，能测定样品中少量或痕量酶；灵敏度高，能测定样品中少量或痕量酶；特异性高，不受体液中其他物质的影响；特异性高，不受体液中其他物质的影响；能测定

44、一些不表现酶活性的酶蛋白；能测定一些不表现酶活性的酶蛋白；特别适用于测定同工酶。特别适用于测定同工酶。6 6、免疫化学测定的局限性：免疫化学测定的局限性：制备足够量的提纯酶和抗血清非常困制备足够量的提纯酶和抗血清非常困难且难且 工作量大；工作量大；测定步骤多，操作繁琐；测定步骤多，操作繁琐；测定成本高。测定成本高。三、同工酶的分析方法三、同工酶的分析方法 方法方法同工酶（或亚型）的性质差同工酶（或亚型）的性质差异异同工酶、亚型同工酶、亚型电泳法电泳法电荷不同电荷不同所有同工酶、亚型所有同工酶、亚型色谱法色谱法 离子交换色谱离子交换色谱电荷不同电荷不同CK，LD免 疫免 疫分 析分 析法法 免疫

45、抑制法免疫抑制法特异性抗体反应性不特异性抗体反应性不同同CK、LD、ACP免疫化学测免疫化学测定法定法特异性抗体反应性不特异性抗体反应性不同同CK、LD、ACP、ALP、AMYACP 免疫沉淀法免疫沉淀法 特异性抗体反应性不同特异性抗体反应性不同 底物特异性分析法底物特异性分析法底物底物Km、亲和力不同、亲和力不同ACP、CK、LD（-羟丁酸）羟丁酸）抑制剂分析法抑制剂分析法对小分子量的抑制剂对小分子量的抑制剂的特异性抑制不同的特异性抑制不同LD（草酸）、（草酸）、ACP（L-酒酒石酸）、石酸）、ALP（L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）pH分析法分析法最适最适pH不同不同LD、AST 热失活分析法热失

46、活分析法热稳定性不同热稳定性不同LD、ALP蛋白酶水解法蛋白酶水解法对蛋白水解酶敏感度不同对蛋白水解酶敏感度不同LD、AST（一）电泳法一）电泳法n同工酶氨基酸组成不同，等电点不同。同工酶氨基酸组成不同，等电点不同。n简单快速、分离效果好，不会破坏酶的简单快速、分离效果好，不会破坏酶的天然状态。天然状态。n应注意巨球分子酶的形成应注意巨球分子酶的形成 酶与免疫球蛋白形成复合物酶与免疫球蛋白形成复合物 酶与其他蛋白形成复合物酶与其他蛋白形成复合物血清血清LDLD同工酶琼脂糖凝胶电泳图谱同工酶琼脂糖凝胶电泳图谱（二）层析法（二）层析法 离子交换层析和亲和层析等常用于同离子交换层析和亲和层析等常用于

47、同工酶的提纯与制备，也可用于临床同工酶工酶的提纯与制备，也可用于临床同工酶常规检测。常规检测。（三）免疫分析法（三）免疫分析法同工酶一级结构不同，免疫化学性质不同。同工酶一级结构不同，免疫化学性质不同。（四）同工酶的其他分析方法（四）同工酶的其他分析方法第三节第三节 常用酶及同工酶测定的常用酶及同工酶测定的 临床应用临床应用一、一、血清酶血清酶（一）一）血清酶的来源血清酶的来源与去路与去路n血浆特异酶：血浆特异酶：主要作为血浆蛋白的固有成主要作为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶。分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶。n非血浆特异酶：非血浆特异酶：在血浆中浓度很低且在血在血浆中浓

48、度很低且在血浆中活性很低的酶。浆中活性很低的酶。外分泌酶：外分泌酶：指来源于外分泌腺的酶。指来源于外分泌腺的酶。细胞酶：细胞酶：指存在于各组织细胞中进行代指存在于各组织细胞中进行代谢的酶类，随着细胞的新陈代谢，有少量谢的酶类，随着细胞的新陈代谢，有少量酶释出酶释出放入血流中。放入血流中。血浆酶的来源血浆酶的来源血浆酶血浆酶 血浆特异酶血浆特异酶 非血浆特异酶非血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶 细胞内酶细胞内酶 酶的区域化分布酶的区域化分布 诊断常用血清酶的来源诊断常用血清酶的来源鸟氨酸氨基甲酰转移酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝肝 谷氨

49、酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝肝山梨醇脱氢酶山梨醇脱氢酶 SDH 肝肝丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠肝、胆、肾、小肠5-核苷酸酶核苷酸酶 5-NT 肝、胆道肝、胆道单胺氧化酶单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌心、肝、骨骼肌肌酸激酶肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALP

50、小肠、胎盘、肝、肾小肠、胎盘、肝、肾酸性磷酸酶酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板前列腺、红细胞、血小板淀粉酶淀粉酶 AMY 胰、唾液腺胰、唾液腺脂肪酶脂肪酶 LPS 胰胰血清酶血清酶 符号符号 来源来源血血清酶的去路清酶的去路血血清酶的半寿期清酶的半寿期(T1/2)(T1/2)：酶失活至原来的一半时所需的时间。是衡酶失活至原来的一半时所需的时间。是衡量酶从血清中清除快慢的指标。量酶从血清中清除快慢的指标。血血清酶的失活和排泄：清酶的失活和排泄：酶主要在血管内失活或分解。酶经蛋白酶酶主要在血管内失活或分解。酶经蛋白酶水解成低分子多肽或氨基酸，重新利用或水解成低分子多肽或氨基酸，重新利用或