现代分子诊断技术详述培训课件.ppt

1、现代分子诊断技术详现代分子诊断技术详述述基因诊断基因诊断基因基因蛋白质蛋白质性状性状生化生化诊断诊断基因基因诊断诊断临床临床诊断诊断2现代分子诊断技术详述v传统的诊断程序传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性生理学特性确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质还是其他物质实践证明实践证明:比较有效比较有效,检测到病原微生物相对比检测到病原微生物相对比较特异较特异诊断成本高、速度慢、效率低诊断成本高、速度慢、效率低如砂眼衣原体、朊病毒如砂眼衣原体、朊病毒3现代分子诊断技术详述方

2、法方法优点优点缺点缺点显微镜镜检显微镜镜检简单易行，可直接观察到简单易行，可直接观察到寄生虫的形态寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生无法辨别形态相近的寄生虫虫体外培养、接种体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料且必须使用动物材料抗体检测抗体检测简单、快速、能够实现自简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的动化，可用于检测大量的样品样品无

3、法区分活的寄生虫与处无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生时会有非特异反应发生DNADNA杂交及杂交及PCRPCR快速灵敏，能够实现自动快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生生虫，不需要以前有寄生虫感染病史虫感染病史花费高，步骤多，无法区花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较4现代分子诊断技术详述v现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进

4、行诊断检测子生物学的方法对病原物质进行诊断检测v一种有效的诊断方法应具备：一种有效的诊断方法应具备：1 1、专一性（、专一性（specificityspecificity）强，诊断只对某一种病原菌分）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应子产生阳性反应2 2、灵敏度、灵敏度(sensitivity)(sensitivity)高高3 3、操作简单、操作简单(simplicity)(simplicity)5现代分子诊断技术详述基因诊断的特点基因诊断的特点v特异性高特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素检测目标是基因，为原始的致病因素v灵敏度高灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需待测标本往往微

5、量，目的基因只需pg水平水平v稳定性高稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态处于活性状态v诊断范围广，适应性强诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态v临床应用前景好临床应用前景好6现代分子诊断技术详述基因诊断优点基因诊断优点v从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制v显著提早产前诊断的时间显著提早产前诊断的时间v无需对组织、器官或细胞进行选择无需对组织、器官或细胞进行选择v快捷准确、安全快捷准确、安全7现代分子诊断技术详述基因诊断常用的技术

6、基因诊断常用的技术核酸分子杂交核酸分子杂交PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）限制性酶切分析限制性酶切分析SSCPSSCP（单链构象多态性分析）（单链构象多态性分析）DNADNA 测序测序 DNADNA 芯片技术芯片技术8现代分子诊断技术详述vDNADNA Southern blot,FISH,PCR,Sequencing,Southern blot,FISH,PCR,Sequencing,micoarray,restriction analysis,RFLPmicoarray,restriction analysis,RFLP，SSCPSSCPvRNARNA Northern b

7、lot,RT-PCR,micoarrays Northern blot,RT-PCR,micoarraysvProteinProtein Western blot,Immuno-histochemistry,Western blot,Immuno-histochemistry,microarray microarray 9现代分子诊断技术详述Southern blotNN T T N T T10现代分子诊断技术详述 FISH11现代分子诊断技术详述PCR技术技术12现代分子诊断技术详述DNADNA测测序序13现代分子诊断技术详述 指在固相支持物上指在固相支持物上原位合成寡核苷酸原位合成寡核苷酸

8、或者直接将或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）由于在制备过程中运用了由于在制备过程中运用了计算机芯片计算机芯片的制备技术的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片硅芯片作为固相作为固相支持物，所以称为支持物，所以称为DNADNA芯片技术芯片技术DNADNA芯片技术的概念芯片技术的概念14现代分子诊断技术详述DNADNA

9、芯片技术原理芯片技术原理v大规模集成的固相杂交大规模集成的固相杂交 v基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、以大量已知序列的寡核苷酸、cDNAcDNA或基因片段作探针，检测或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息测样品的基因序列及表达的信息15现代分子诊断技术详述DNA芯片技术流程BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayervMicr

10、oarray fabricationvSample preparationvMolecular hybridizationvDetection and analysis16现代分子诊断技术详述17现代分子诊断技术详述基因诊断的原理基因诊断的原理v利用分子生物学和分子遗传学的技术，从利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNADNA或或RNARNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法而对疾病做出诊断的方法v策略策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检

11、测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因检测表型克隆基因18现代分子诊断技术详述基因治疗的机理基因治疗的机理v 基因置换：正常基因取代致病基因基因置换：正常基因取代致病基因v 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列v 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能v 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达v 基因封闭：封闭特定基因的表达基因封闭：封闭特定基因的表达v“自杀基因自杀基因”的应用的应用v 免疫基因的治疗免疫基因的治疗v 耐药基因的治疗耐药基因的治疗19现

12、代分子诊断技术详述 美国医学家美国医学家W F 安德森等人对腺甘脱氨安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例世界上第一个基因治疗成功的范例 谢德尔，谢德尔，199920现代分子诊断技术详述21现代分子诊断技术详述22现代分子诊断技术详述23现代分子诊断技术详述n 分子诊断分子诊断l 利用利用PCRPCR技术或技术或PCRPCR与分子杂交与分子杂交标记相结合，可标记相结合，可以快速准确地检以快速准确地检测出病原性物质。测出病原性物质。24现代分子诊断技术详述n 分子诊断分子诊断羊水和胎盘绒毛膜检测25现代分子诊断技术

13、详述第一节酶联免疫吸附测定第一节酶联免疫吸附测定v抗体高度特异地与抗原分子结合抗体高度特异地与抗原分子结合v通过抗原通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测抗体的特异识别反应进行检测酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)immunosorbant assay,ELISA)26现代分子诊断技术详述一、酶联免疫吸附测定的原理一、酶联免疫吸附测定的原理工作原理：工作原理：v主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合v假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于假定目标分

14、子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体27现代分子诊断技术详述二、检测过程：二、检测过程：将待测样品结合在固相支持物（如将待测样品结合在固相支持物（如9696孔的微量滴定孔的微量滴定板）上板）上加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary antibodyprimary antibody）,反应后冲洗，将未结

15、合上的反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去一抗洗去加入二抗（加入二抗（secondary antibodysecondary antibody），二抗通常只特），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去与一抗结合的二抗洗去加入无色底物加入无色底物28现代分子诊

16、断技术详述双抗体夹心法双抗体夹心法v检测大分子抗原检测大分子抗原29现代分子诊断技术详述间接法间接法v检测抗体检测抗体30现代分子诊断技术详述竞争法竞争法v测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体31现代分子诊断技术详述双夹心法双夹心法v测定大分子抗原测定大分子抗原特异性相同，来源不同特异性相同，来源不同32现代分子诊断技术详述3、使用多克隆抗体的缺点、使用多克隆抗体的缺点同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异的抗体的量之间也会有差异无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与

17、非病原分子之无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在因为在ELISA检测中都会发生颜色变化检测中都会发生颜色变化v单克隆抗体特异性强单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置只结合抗原上某一单一位置33现代分子诊断技术详述4、酶联免疫吸附测定的局限性、酶联免疫吸附测定的局限性v仅凭仅凭ELISAELISA结果容易造成误诊，结果容易造成误诊，ELISAELISA检测只能作检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行行weste

18、rnwestern检测检测v要提高要提高ELISAELISA检测的准确度检测的准确度,就必须提高一抗的特就必须提高一抗的特异性异性v在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的点的基因要表达，基因要表达，而且目标位点而且目标位点不能够以任何方不能够以任何方式被覆盖或阻断式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结否则都将影响抗体与抗原的结合合34现代分子诊断技术详述第二节第二节 DNA诊断系统诊断系统vDNA诊断的理论基础：诊断的理论基础：任何一个决定生物学任何一个决定生物学特性的特性的DNADNA序列都应该是独特的，都可以作序列都应该是独特的，都可以

19、作为专一性的诊断标记为专一性的诊断标记35现代分子诊断技术详述一、核酸杂交一、核酸杂交1、工作原理：、工作原理：两条两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成链之间可以通过碱基配对而形成氢键氢键2、3个关键要素：个关键要素：探针探针DNA 目的目的DNA 信号检测信号检测36现代分子诊断技术详述主要依据：主要依据：碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性 DNA与与DNA杂交：杂交：A=T、GC;DNA与与RNA杂交杂交:A=U、GC;变性：变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补随温度逐渐恢复，变

20、性的两条单链重新形成互补双链双链碱基互补碱基互补37现代分子诊断技术详述38现代分子诊断技术详述核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针39现代分子诊断技术详述3、杂交探针、杂交探针v必须是高度特异性的必须是高度特异性的DNADNA片段片段v种级探针：区分两个或多个物种种级探针：区分两个或多个物种v亚种级

21、探针：区分物种内特定的株系亚种级探针：区分物种内特定的株系vDNADNAvRNARNAv化学合成或克隆的完整基因化学合成或克隆的完整基因v基因的一个片段基因的一个片段40现代分子诊断技术详述 利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理，原理，可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在源核酸序列的存在 核酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断，能与片断，能与待测样本

22、中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列源序列 探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、（生物素、地高辛、荧光素等）两大类荧光素等）两大类41现代分子诊断技术详述v分离杂交探针的方法：分离杂交探针的方法：1.1.提取某一病原微生物株系的染色体提取某一病原微生物株系的染色体DNADNA2.2.限制性内切酶进行酶解限制性内切酶进行酶解 3.3.得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 4.4.文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性文库中重组质粒

23、的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核微生物和非病原性微生物的核DNADNA进行杂交、筛选进行杂交、筛选42现代分子诊断技术详述v核酸杂交的灵敏度和可靠性极高核酸杂交的灵敏度和可靠性极高v用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化进行杂交，且无需预先纯化DNAv若样品中的目标分子非常少，则需通过若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的将目的序列扩增，再进行杂交检测序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用从理论上讲，用DNADNA杂交来诊断疾病可用杂交来诊断疾病可用于对

24、所有的致病微生物的检测于对所有的致病微生物的检测43现代分子诊断技术详述4、非同位素标记探针、非同位素标记探针v3232P P的缺点：的缺点：半衰期短，仅半衰期短，仅1313天天操作起来比较危险操作起来比较危险必须要有特殊的实验室设备进行操作必须要有特殊的实验室设备进行操作放射性垃圾的处理繁琐放射性垃圾的处理繁琐44现代分子诊断技术详述v非放射性杂交检测系统：非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的发光物质而达到放大信号的目的v采用将生物素（采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入）标记的核苷酸掺

25、入DNA的的方法制备探针方法制备探针v生物素标记的生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年在室温下至少可保存一年v检测发光和颜色变化可在几小时内完成检测发光和颜色变化可在几小时内完成45现代分子诊断技术详述BBBBAPBBAP生物素生物素加入链霉素抗生物蛋白加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶加入生物素标记的碱性磷酸酶探针探针目的目的DNA加入不同的生色或化学发光底物加入不同的生色或化学发光底物46现代分子诊断技术详述荧光标记的引物直接进行荧光标记的引物直接进行PCR检测检测DNA引物引物1引物引物2荧光染料荧光染料PCR层析层析荧光检测荧光检测游离引物游离引物47现代分子诊断技术详

26、述v分子夹心探针检测分子夹心探针检测发出荧光发出荧光分子夹心探针分子夹心探针(没有荧光没有荧光)荧光团荧光团猝灭剂猝灭剂目的目的DNA与目的与目的DNA杂交杂交48现代分子诊断技术详述TaqMan探针技术探针技术v原理：原理：利用利用Taq酶的酶的3 5外切核酸酶活性，切断探针，外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量的强弱就代表了模板的数量49现代分子诊断技术详述3553QR上游上游引物引物下游下游引物引物5 335 QRTaqMan探针的荧光信号产生机制探针的荧光信号产生机制50现代分子诊断技

27、术详述疟疾的分子诊断：疟疾的分子诊断：v检测是否存在疟原虫检测是否存在疟原虫1.抽取血样进行镜检抽取血样进行镜检 2.免疫诊断免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染无法区分是以前感染还是现在感染3.DNA杂交诊断杂交诊断例一：例一：51现代分子诊断技术详述vDNADNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNADNA序列序列v具体的分离过程：具体的分离过程：1.1.构建一个疟原虫的核基因文库构建一个疟原虫的核基因文库2.2.用标记的疟原虫核用标记的疟原虫核DNADNA作探针去筛选核基因文库作探针去筛选核基因文

28、库3.3.选出那些杂交信号最强的克隆选出那些杂交信号最强的克隆4.4.用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为为DNADNA探针的可靠性探针的可靠性52现代分子诊断技术详述锥虫的检测锥虫的检测v锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞v显微镜检新鲜血液显微镜检新鲜血液v取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40,3

29、0-40天后天后杀死昆虫杀死昆虫,镜检昆虫的肠道镜检昆虫的肠道v免疫检测免疫检测:假阳性高假阳性高例二：例二：53现代分子诊断技术详述vPCR检测检测v针对针对锥虫特有的一段锥虫特有的一段188bp的的DNA序列设计序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带的条带54现代分子诊断技术详述二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术v抗生素的不合理使用抗生素的不合理使用vDNA杂交杂交vPCR检测检测v噬菌体介导噬菌体介导55现代分子诊断技术详述DNA杂交杂交v设计设计16SrRNA16SrRNA为探针为探

30、针v16SrRNA16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性在细菌中拷贝数极高，高度的保守性v特异性不是很好特异性不是很好v必须结合必须结合PCRPCR技术技术56现代分子诊断技术详述PCR检测检测vnested PCRnested PCRv针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物物 每对引物都能特异的扩增出一每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加57现代分子诊断技术详述模板模板使用外引物，进行第一使用外引物，进行第一次次PCR扩增扩增使用内引物，进行第二使用内引物，进行第二次次PCR扩增

31、扩增第一次第一次PCRPCR扩扩增产物增产物第二次第二次PCRPCR扩扩增产物增产物巢式巢式PCRPCR原理示意图原理示意图58现代分子诊断技术详述vPCR技术也会产生假阳性技术也会产生假阳性1.1.新扩增的目的新扩增的目的DNADNA特异性不强特异性不强2.2.退火温度过低退火温度过低3.3.模板中杂质的污染模板中杂质的污染v假阴性假阴性1.1.存在存在TaqTaq酶的抑制剂酶的抑制剂2.2.模板量过少模板量过少3.3.模板模板DNADNA纯度不够纯度不够59现代分子诊断技术详述v原位原位PCR(in situ PCR,ISPCR)v在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩在细胞或细胞切

32、片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测增，并通过原位杂交进行检测v不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位胞中定位60现代分子诊断技术详述原位杂交原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的进而检测特异的DNADNA或或RNARNA序列序列 细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADN

33、A-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点：不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态有有61现代分子诊断技术详述噬菌体介导细菌检测噬菌体介导细菌检测v将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品基因噬菌体去侵染待测样品v噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加

34、入荧光素的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和和ATPATP，就会有荧光产生，就会有荧光产生v结核菌的检测结核菌的检测v抗药性菌株的检测抗药性菌株的检测62现代分子诊断技术详述荧光素酶荧光素酶荧光素荧光素ATP荧光荧光利用宿主细胞利用宿主细胞转录、翻译转录、翻译噬菌体基因噬菌体基因荧光素酶荧光素酶基因基因宿主细菌宿主细菌噬菌体介导的细菌检测噬菌体介导的细菌检测63现代分子诊断技术详述第三节第三节 DNA指纹指纹v每个人体细胞内都含每个人体细胞内都含有有23对染色体，每条对染色体，每条染色体中部含有一个染色体中部含有一个DNA分子，分子，DNA分子分子中的核苷酸序列包含中的核苷酸序列包含

35、着遗传信息，在着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重度重复序列、高度重复序复序64现代分子诊断技术详述v每个重复序列在每个重复序列在300300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要列经过超离心后以卫星带出现在主要DNADNA带的附近，所以也带的附近，所以也称卫星称卫星DNADNA，其中的重复序列单元则称为，其中的重复序列单元则称为“小卫星小卫星DNA”DNA”v“小卫星小卫星”具有高度的可变性，但在具有高度的可变性，但在“小卫星小卫星DNA“DNA“中有中

36、有一小段序列则在所有个体中都一样，称为一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列核心序列”。如。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNADNA进行进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作一样具有专一性和特异性，因此称作“DNADNA指纹指纹”v 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99999999的碱的碱基序列都相同，而剩下的基序列都相同，而剩下的0.01%0.01%的碱基特征序列则来自于双的碱基

37、特征序列则来自于双亲，据此可用于亲，据此可用于“亲子鉴定亲子鉴定”65现代分子诊断技术详述所罗门的审判：所罗门的审判：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是 所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其 辟成两半分给他们两，辟成两半分给他们两，结果假母亲同意所罗结果假母亲同意所罗 门的判决，而孩子真门的判决，而孩子真 正的母亲却恳求侍卫正的母亲却恳求侍卫 饶了孩子的性命，她饶了孩子的性命，她 解释说：解释说：“把孩子给了把孩子给了 假母亲

38、，总比让孩子假母亲，总比让孩子 惨死好。惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了当然，真假母亲也就水落石出了。66现代分子诊断技术详述滴骨验亲法：滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。多种记录。三国时代（公园三国时代（公园220280220280年）谢承著年）谢承著会稽会稽先贤传先贤传中的中的以弟血滴兄骨以弟血滴兄骨可能是记录此法的可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的

39、有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。67现代分子诊断技术详述合血法：合血法：等到了明代，更是采用了等到了明代，更是采用了“合血法合血法”来识别亲来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺子兄弟或自幼分离，

40、欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”68现代分子诊断技术详述方法：方法：vDNADNA指纹是指对待测样品中的指纹是指对待测样品中的DNADNA进行分析所进行分析所得到的具有特征性的得到的具有特征性的DNADNA分子杂交图谱分子杂交图谱vDNA DNA 酶解酶解 电泳电泳 转膜转膜 杂交杂交v最常用的最常用的DNADNA探针是微卫星序列探针是微卫星序列受害者血样受害者血样犯罪嫌疑人犯罪嫌疑人衣物上血样衣物上血样犯罪嫌疑犯罪嫌疑人血样人血样69现代分子诊断技术详述70现代分子诊断技术详述71现代分子诊断技术详述第四节第四节

41、 遗传性疾病的分子诊断技术遗传性疾病的分子诊断技术直接诊断直接诊断点突变点突变间接诊断间接诊断多态性连锁分析多态性连锁分析72现代分子诊断技术详述73现代分子诊断技术详述74现代分子诊断技术详述遗传性疾病的分子诊断技术遗传性疾病的分子诊断技术vPCR酶解鉴定酶解鉴定vPCROLA鉴定鉴定vPCR-ELISA检测检测vPCR-DGGE鉴定鉴定v扩增阻滞突变系统（扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）v连接酶链反应（连接酶链反应（LCR）75现代分子诊断技术详述镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anem

42、ia)v典型的单基因遗传性疾病典型的单基因遗传性疾病 v血红蛋白的血红蛋白的链（链（珠蛋白）的第六个氨基酸珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发发生突变成生突变成Val76现代分子诊断技术详述血红蛋白血红蛋白 -链上链上 谷氨谷氨酸酸变成变成缬氨缬氨酸酸77现代分子诊断技术详述 78现代分子诊断技术详述一、一、PCR酶解鉴定酶解鉴定v 正常基因为正常基因为CCTGAGGCCTGAGGv镰刀形贫血病患者的基因为镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGGCCTGTGGv限制性内切酶限制性内切酶CvnCvnI I的识别序列为的识别序列为CC TNAGGCC TNAGG79现代分子诊断技术详述v方法方法:1.1.

43、在在CvnCvnI I位点的两点设计两个引物位点的两点设计两个引物;2.2.包含包含CvnCvnI I位点区域的位点区域的DNADNA片段通过片段通过PCRPCR扩增扩增出来出来;3.3.扩增的扩增的DNADNA用用CvnCvnI I酶处理，酶解产物用凝胶酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查灯下检查DNADNA带型。带型。80现代分子诊断技术详述38225620118188条带大小条带大小(bp)正常纯合子正常纯合子杂合子杂合子突变纯合子突变纯合子CvuI处理处理CvuICvuICvuI256bp201bp181bp88bpCv

44、uICvuI256bp382bp88bp正常情况正常情况镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症PCR 扩增扩增引物引物1引物引物2PCR产物（长产物（长726bp）81现代分子诊断技术详述二、二、PCR/OLA鉴定鉴定vOLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡寡聚核苷酸连接分析聚核苷酸连接分析v假定一个正常的基因在一个特定的位置发假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说生了突变，比如说150位的位的T突变为突变为G v根据根据150150位两边的序列，人工合成两段短的位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因核苷酸链，使这两段寡

45、聚核苷酸链与基因的一条链互补的一条链互补v探针探针X：寡聚核苷酸链的：寡聚核苷酸链的3端最后一个核苷酸正端最后一个核苷酸正好与正常基因的好与正常基因的150位的的核苷酸配对位的的核苷酸配对v探针探针Y：另一段寡聚核苷酸链的：另一段寡聚核苷酸链的5端第一个核苷端第一个核苷酸与酸与151位的核苷酸配对位的核苷酸配对82现代分子诊断技术详述 正常基因正常基因 探针探针X3端最后一个核苷酸端最后一个核苷酸就不会与目的基因就不会与目的基因150位位的核苷酸配对的核苷酸配对由于由于3最后一个核苷酸不配对而使最后一个核苷酸不配对而使两个探针无法实现连接两个探针无法实现连接目的基因突变目的基因突变两探针与目的

46、基因的两探针与目的基因的完美配对完美配对两个探针就可连两个探针就可连接起来接起来加入加入DNA 连接酶连接酶83现代分子诊断技术详述B150 151DBD150 151BXY150 151DBD双链目的双链目的DNA或或PCR产物产物热变性热变性单链目的单链目的DNA或或PCR产物产物加探针退火加探针退火完全配对完全配对模板有突变模板有突变,不完全配对不完全配对连接酶连接酶连接酶连接酶加入链霉抗生加入链霉抗生物素蛋白物素蛋白加入链霉抗生加入链霉抗生物素蛋白物素蛋白84现代分子诊断技术详述BDB加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶加入无色底物加入无色底物加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶加入无色底物加入无色底

47、物BDAP变色变色无色底物无色底物有色底物有色底物B保持无色保持无色无色底物无色底物PCR/OLA分析程序示意图分析程序示意图85现代分子诊断技术详述（1 1）提取）提取DNADNA，热处理成为单链，热处理成为单链DNADNA；（2 2）以单链）以单链DNADNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行物进行PCRPCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；（3 3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASOASO）杂交。）杂交。86现代分子诊断技术详述三、三、PCR-EL

48、ISA检测检测v在在PCRPCR反应体系中加入生物素标记的反应体系中加入生物素标记的dUTPdUTP和其和其他他3 3种种dNTPdNTPv33端经端经DIGDIG标记特异性探针标记特异性探针v包被有抗生物素抗体的酶标板包被有抗生物素抗体的酶标板v抗碱性磷酸酶（抗碱性磷酸酶（APAP）DIGDIG抗体抗体v如果加入的如果加入的DIGDIG标记的探针可与扩增片段结合，标记的探针可与扩增片段结合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜色的变化色的变化87现代分子诊断技术详述四、四、PCR-DGGEPCR-DGGE法法v原理原理变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳

49、（DGGEDGGE）是一种根据）是一种根据DNADNA片段片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统的熔解性质而使之分离的凝胶系统TmTm值主要取决于值主要取决于DNADNA分子中分子中GCGC含量的多少含量的多少 DGGEDGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度将凝胶设置在双重变性条件下：温度5060 5060，变性剂，变性剂0100%0100%当一双链当一双链DNADNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段相当于此段DNADNA的低熔点区的的低熔点区的TmTm值，此区便开始值，此区

50、便开始熔解，而高熔点区仍为双链熔解，而高熔点区仍为双链88现代分子诊断技术详述v原理原理同样长度但序列不同的同样长度但序列不同的DNADNA片段会在胶中不同位片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解链的链的DNADNA片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成相互分开的条带图谱相互分开的条带图谱不同不同DNADNA片段的序列差异发生在最高的解链区域片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个高熔点区高熔点区GCGC夹，即在一侧引物的夹