液相色谱故障诊断课件.ppt
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- 关 键 词:
- 色谱 故障诊断 课件
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1、峰峰 型型所有的峰都展宽柱效降低柱死体积大进样量/质量高粘度流动相 部分峰展宽前次进样后流出的组分大分子量样品蛋白或聚合物峰展宽样品与流动相不匹配峰峰 型型拖尾峰对称性 1.2NormalTailingNormalTailing原因:原因:部分峰拖尾二次保留效应残留硅醇基的反应小峰紧跟在大峰的后面流出柱头有污染金属所有峰拖尾额外的柱效应柱坏/不适当的溶剂不适当的样品量峰峰 型型正常峰伸舌峰前伸峰不对称性 0.9可能的原因可能的原因柱过载在大峰前,有小峰流出样品溶剂不适当柱死体积过滤片部分堵塞峰峰 型型原因:流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)
2、低于流动相宽宽 峰峰柱外体积增加*在进样口到柱或柱到检测器之间,使用细的短的连接管*保证所有的管路接头都使用正确*用小体积检测池*减少进样量或降低样品浓度HPLC常见问题系统压力问题压力高压力低或没有压力压力不稳流路基线噪音问题基线不稳定(不重复)长、短程振荡基线漂移噪音脉冲尖刺HPLC常见问题分析系统压力问题压力高的原因温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题HPLC常见问题分析(续)系统压力问题压力低或没有压力温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相储液瓶中无溶剂 低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵 入口管路中有空气泵失效系统内有渗漏处所用溶剂不
3、正确自动进样器在Purge时卡住HPLC常见问题分析(续)系统压力问题压力不稳压力传感器问题泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发HPLC常见问题分析(续)流路基线噪音问题短程振荡泵压不稳泵入口管松,弯或堵塞溶剂混合不充分检测池中有大气泡泵入口阀脏或失效泵柱塞杆密封垫磨损检测器出口溶液成滴状流入废液瓶判断故障与故障排除的原则 规则一 确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复 出现,很难证实其确实存在。规则二 一次只变化一个因素,以使你能够确认所变因 素与问题之间的关联。规则三 恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题 之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则,换下的组件
4、将来很难再利用,会造成浪费。规则四 尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故 障排除经验来改善您目前的预防保养工作,使现 有问题再发率降至最低。规则五 养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行 故障排除的关键。色谱图常见问题色谱图常见问题主要有两类:色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等色谱图常见问题分析(一)色谱峰峰形异常问题:色谱图中未出峰:进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确,或检测器有问题一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流
5、动相色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效(选择合适的柱子)进样问题检测器时间常数不正确平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品
6、浓度太高色谱峰保留时间问题:保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱图常见问题分析(二)色谱峰保留时间问题:保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏色谱图常见问题分析(二)(续)色谱图常见问题分析(二)(续)色谱峰保留时间问题:保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化;柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动
7、相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养色谱柱的选择 非极性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的C18C18柱柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的过的C18C18柱,柱,PHPH范围范围2-92-9(1212)糖类,氨基酸,有机酸,多环芳烃,糖类,氨基酸,有机酸,多环芳烃,GPCGPC有有专用柱专用柱键合相色谱柱以硅胶为基质,通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70%优点 固定相稳定,不易流失 应用广泛,可使用多种溶剂
8、 消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料,各种牌号色谱柱不尽相同反相HPLC柱(C18)的性能 常规C18填料的稳定性 硅胶基质填料 pH范围:2-8 pH值大于7时键合相粉碎或溶解 pH值小于2时键合相的化学键断裂 经常用缓冲液 固定相降解 填料新的键合技术 -PH范围 2-12 -稳定性好,使用寿命长1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅胶的溶解曲线良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时,先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图,并记录条件 定期检测柱效色谱柱的使用及操作 流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱 样品及溶剂的
9、要求记住拿到一根从未用过的色谱柱时记住拿到一根从未用过的色谱柱时 一定要先看其使用说明!一定要先看其使用说明!色谱柱的保养(一)样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品准备为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析结果的影响。护作用,消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的
10、细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。损。样品过滤头的类型:样品过滤头的类型:30mm 内径:适用于大进样量的过滤,由内径:适用于大进样量的过滤,由0.2m 和和0.45m 两种规格两种规格,材料有纤维素材料有纤维素,醋酸纤维醋酸纤维,聚四氟乙烯。聚四氟乙烯。处理样品体积少于处理样品体积少于50l。13mm 内径:适用于范围广的过滤,由内径:适用于范围广的过滤
11、,由0.2m 和和0.45m 两种规格两种规格,材料为纤维素。材料为纤维素。3mm 内径:适用于小进样量的过滤,由内径:适用于小进样量的过滤,由0.2m 和和0.45m 两种规格。处理样品体积为两种规格。处理样品体积为7l。色谱柱的保养(二)流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水,梯度实验时水中有机杂质含量要低(建议走空白检验)缓冲液的pH值,在填料的允许范围内 缓冲液(盐)的浓度 溶剂:色谱纯,并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性,避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例溶剂过滤-除去微粒 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。遵
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