荧光原位杂技技术和其临床应用培训课件.ppt

1、荧光原位杂技技术和其荧光原位杂技技术和其临床应用临床应用荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 90 年代以后年代以后,随着分子生物学技术的提高随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透以及向各学科的渗透,出现了一种新的运用分出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法子手段分析染色体异常的方法,即即:染色体荧染色体荧光原位杂交光原位杂交(FISH)技术技术,该技术不仅可用于中该技术不仅可用于中期分裂相期分裂相,还可在间期细胞显示杂交信号还可在间期细胞显示杂交信号,尤其尤其适用于那些培养难以成功的各种组织细胞。适用于那些培养难以成功的各种组织细胞。2荧光原位杂技技术和其临床应用由细胞到由细胞到DN

2、A分子分子3荧光原位杂技技术和其临床应用荧光原位杂交技术的基本概念1.脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)分子分子2.脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)探针探针3.脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)变性变性4.脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)杂交杂交4荧光原位杂技技术和其临床应用荧光原位杂交原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。杂交双链核酸。5荧光原位杂技技术和其临床应用荧光

3、原位杂交技术荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（简称FISH）是用细）是用细胞遗传学和分子生物学的原理，通过荧光标记胞遗传学和分子生物学的原理，通过荧光标记的核酸探针与细胞内的核酸序列杂交。借助荧的核酸探针与细胞内的核酸序列杂交。借助荧光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。6荧光原位杂技技术和其临床应用荧光原位杂交示意图荧光原位杂交示意图7荧光原位杂技技术和其临床应用常见的

4、荧色物常见的荧色物荧色物荧色物激发（激发（nmnm）散发（散发（nmnm）DAPIDAPI达比达比350350470470FITCFITC异氰酸荧光素异氰酸荧光素490490525525Texas RedTexas Red德克莎斯红颜德克莎斯红颜料料5965966156158荧光原位杂技技术和其临床应用荧光显微镜系统荧光显微镜系统9荧光原位杂技技术和其临床应用探针的标记的种类及比较探针的标记的种类及比较 1.探针标记方法主要有两类：探针标记方法主要有两类：（1）直接标记法，就是荧光素通过一些方法直）直接标记法，就是荧光素通过一些方法直接连接到核酸序列上。接连接到核酸序列上。（2）间接标记法，就

5、是把地高辛或生物素等半）间接标记法，就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列抗原连接到核酸序列，然后在杂交过后的检测，然后在杂交过后的检测阶段，加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参阶段，加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参与反应进行检测。与反应进行检测。10荧光原位杂技技术和其临床应用探针的标记的种类及比较探针的标记的种类及比较 2.这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强；法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强；间接法具有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，间接法具有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，但是间接法杂交

6、过后检测步骤繁琐，背景信号强。但是间接法杂交过后检测步骤繁琐，背景信号强。近年来荧光的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高近年来荧光的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针越来越成为首选直接标记的荧光探针越来越成为首选,并采用多并采用多种不同颜色的荧光种不同颜色的荧光,方便在同一标本上同时检测方便在同一标本上同时检测多种异常多种异常.其荧光强度和信号大小都易于在普通其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察,操作过程中也不需要严格避操作过程中也不需要严格避光光,鉴于直接标记法已经可以获得较满意的信号，鉴于直接标记法已经可以获得较满意的信号，目前临床检测用的探针多为直

7、接标记法标记。目前临床检测用的探针多为直接标记法标记。11荧光原位杂技技术和其临床应用临床常用的探针临床常用的探针 临床使用的探针都是以临床使用的探针都是以DNA 为主。为主。常用探针主要有：常用探针主要有：（1）着丝粒探针。）着丝粒探针。CEP:Chromosome Enumeration DNA Probes（2）位点特异型探针。）位点特异型探针。LSI:Locus specific identifier（3）染色体涂染探针。）染色体涂染探针。WCP:Whole Chromosome Paints12荧光原位杂技技术和其临床应用着丝粒着丝粒探针探针 a.高度重复序列高度重复序列DNA ,重

8、复数百次至数千次，重复数百次至数千次，其靶序列通常是在染色体的其靶序列通常是在染色体的p11-q11区域及异染区域及异染色质区域。色质区域。b.特点：信号强特点：信号强 c.应用应用 (a)标记染色体识别。标记染色体识别。(b)染色体数目异常检测。染色体数目异常检测。(c)间期细胞遗传学研究和临床诊断。间期细胞遗传学研究和临床诊断。13荧光原位杂技技术和其临床应用着丝粒着丝粒探针探针染色体的着丝粒染色体的着丝粒异染色质域异染色质域14荧光原位杂技技术和其临床应用位点特异型探针位点特异型探针 a.标记了荧光信号的标记了荧光信号的DNA片段代表了某一个或几个片段代表了某一个或几个基因位点的全部序列

9、。主要用以染色体基因位点的全部序列。主要用以染色体DNA 克隆克隆序列的定位和靶序列的定位和靶DNA 序列拷贝数及结构变化的检序列拷贝数及结构变化的检测。测。b.特点：信号较小。特点：信号较小。c.应用应用:（a）定位）定位DNA片段。片段。（b）确定染色体微小缺失与重复。）确定染色体微小缺失与重复。（c）间期细胞染色体数目异常诊断。）间期细胞染色体数目异常诊断。15荧光原位杂技技术和其临床应用 16号和22号染色体探针信号位点特异型探针位点特异型探针16荧光原位杂技技术和其临床应用染色体涂染探针染色体涂染探针a.涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂

10、染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体重排和标记染色体的确定。能对整条染色体进行重排和标记染色体的确定。能对整条染色体进行荧光标记荧光标记b.特点：结果容易判读。然而，整条染色体涂染特点：结果容易判读。然而，整条染色体涂染 探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。位。c.应用：应用：（1）染色体数目和结构异常分析。）染色体数目和结构异常分析。（2）白血病及其它肿瘤的染色体诊断）白血病及其它肿瘤的染色体诊断 和研究。和研究。17荧光原位杂技技术和其临床应用染色体涂染探针：染色体涂染探针：染色体结构异常分析染

11、色体结构异常分析18荧光原位杂技技术和其临床应用FISH技术包括下列几个步骤技术包括下列几个步骤1）备制玻片）备制玻片2）标本变性）标本变性3）探针变性）探针变性4）杂交）杂交5）DAPI复染复染5）荧光显微镜观察）荧光显微镜观察FISH结果结果19荧光原位杂技技术和其临床应用羊水标本采集羊水标本采集 a.在B 超腹部探头引导下行羊膜腔穿刺，抽 取羊水20ml，其中15ml 用于常规羊水细胞培 养,5ml用于FISH 检测。20荧光原位杂技技术和其临床应用未培养羊水细胞制片未培养羊水细胞制片 取羊水5ml，1800rpm 离心弃上清，加1mg/ml Hanks 胶原酶B 5ml，37 水浴30

12、 min，1800rpm 离心去上清，加0.075M KCl 5ml，37 水浴低渗20min，加甲醇:乙酸=3 1固定液2ml 预固定，1800rpm 离心去上清，加5ml 固定液轻轻混匀，固定10min，1800rpm 离心去上清，再重复固定1 次，制成细胞悬液，滴片备用。21荧光原位杂技技术和其临床应用杂交前预处理杂交前预处理 将玻片于2 SSC 溶液中浸泡10min，然后放入0.1MHCl 浸泡10min，再放入2 SSC 溶液中浸泡5min，然后放入预热到37的 0.01MHCl(放入玻片前，0.01MHCl 中预先加入20mg/ml 胃蛋白酶160l)中消化8 10min，经过2

13、SSC 溶液再次浸泡5min 后，用70%、85%、100%乙醇中梯度脱水，每次3min，自然晾干，56烤片2min。22荧光原位杂技技术和其临床应用标本的变性标本的变性 玻片置73变性液(70%甲酰胺)中 5min，然后分别置于 20的70%、85%、100%冰乙醇中各脱水各3min，自然晾干，45 50烤片。23荧光原位杂技技术和其临床应用探针变性探针变性 按照比例(杂交缓冲液:探针:水=7 2 1)混合，离心1 3s，73 变性5min，45 50 放置5 10min。(允许FISH探针和目标DNA同时联合变性)24荧光原位杂技技术和其临床应用杂交杂交 将10l 探针置于杂交区内，覆盖盖

14、玻 片，封片胶封边，置保湿盒恒温42杂交 10 16h。25荧光原位杂技技术和其临床应用洗脱洗脱 拆片，在46水浴中，50%甲酰胺/2 SSC 液洗涤3 次，每次7min;2 SSC 液洗涤10min;0.1%np 40/2 SSC 洗涤5min。室温70%乙醇洗涤3min，暗处自然晾干。26荧光原位杂技技术和其临床应用DAPI 染色和荧光镜检染色和荧光镜检 DAPI 染色和荧光镜检:每片加DAPI 10l，盖上盖玻片，染色15 20min，结果用荧光显微镜观察，选择背景干净、杂交信号清晰形态圆形或近于圆形的细胞记数，并照像。27荧光原位杂技技术和其临床应用临床实验中临床实验中FISH 结果判

15、别结果判别 每张羊水玻片至少计数50 个细胞，判断 标准为:若正常细胞数90%则判为正常，若 异常细胞数60%则判为异常，若异常细胞数 大于15%并且小于60%，则需要重新检测并加 倍计数到100 以上。28荧光原位杂技技术和其临床应用FISH 检测结果检测结果 采用双色采用双色13/21 号染色体荧光探针检测号染色体荧光探针检测 13 号、号、21 号染色体正常胎儿可见号染色体正常胎儿可见2个绿色荧个绿色荧光信号和光信号和2 个红色荧光信号。个红色荧光信号。29荧光原位杂技技术和其临床应用FISH 检测结果检测结果 13 号染色体正常可见号染色体正常可见2个绿色荧个绿色荧光信号，光信号，21

16、 号染色体三体胎儿可见号染色体三体胎儿可见3 个红色荧光信号。个红色荧光信号。30荧光原位杂技技术和其临床应用FISH用于用于产前诊断主要探针产前诊断主要探针 染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，其中其中13号、号、18 号、号、21 号、号、X、Y 染色体数目异常染色体数目异常最为常见，最为常见，由于由于13，18，21，X 和和Y 这这5 种染色种染色体的非整倍体异常约占所有染色体异常的体的非整倍体异常约占所有染色体异常的6580，占染色体异常导致出生缺陷的，占染色体异常导致出生缺陷的8595，因此因此FISH 用于快速产前诊断主要是针对这用于快

17、速产前诊断主要是针对这5 种染种染色体设计使用荧光标记的探针。色体设计使用荧光标记的探针。31荧光原位杂技技术和其临床应用FISH 用于产前诊断的指征用于产前诊断的指征a.妊娠妇女血清学筛查妊娠妇女血清学筛查 风险高危者（大于等于风险高危者（大于等于1/270)及临界及临界风险者风险者(小于小于1/270至大于等于至大于等于1/1000）。）。b.妊娠妇女到预产期时高龄年龄妊娠妇女到预产期时高龄年龄35 岁。岁。c.双亲之一为易位携带者。双亲之一为易位携带者。d.不良孕产史。不良孕产史。e.超声检查胎儿异常者。超声检查胎儿异常者。32荧光原位杂技技术和其临床应用FISH敏感度和特异度均较高敏感

18、度和特异度均较高 FISH 用于产前诊断检测的敏感度和特异度均较高。用于产前诊断检测的敏感度和特异度均较高。例例1.有报道有报道FISH 检测检测4 500 例未培养羊水细胞，对于常例未培养羊水细胞，对于常染色体的敏感度为染色体的敏感度为92.6%，特异度为，特异度为100；性染色体敏；性染色体敏感度为感度为100，特异度为，特异度为99.9%。例例2.Tepperberg 等总结美国等总结美国25 个实验室应用个实验室应用FISH 检检测测5 348 例羊水资料，结果敏感度为例羊水资料，结果敏感度为99.6%，特异度为，特异度为99.98%，阳性预测值为，阳性预测值为99.8%，阴性预测值为

19、，阴性预测值为99.96%。例例3.Caine 等回顾性分析等回顾性分析24 742 例例FISH检测羊水间期细检测羊水间期细胞的敏感度为胞的敏感度为99.54%，特异度为，特异度为99.97%，阳性预测值为，阳性预测值为99.54%，阴性预测值为，阴性预测值为99.97%；由此可见，由此可见，FISH 用于快速产前诊断的准确性较高。用于快速产前诊断的准确性较高。33荧光原位杂技技术和其临床应用FISH产前诊断技术临床应用产前诊断技术临床应用 染色体数目异常是引起新生儿先天性遗传病染色体数目异常是引起新生儿先天性遗传病的主要因素之一。传统的羊水细胞培养、染色体的主要因素之一。传统的羊水细胞培养

20、、染色体核型分析是宫内产前诊断胎儿染色体疾病的主要核型分析是宫内产前诊断胎儿染色体疾病的主要方法方法,但该方法所需时间长、技术难度大、易受但该方法所需时间长、技术难度大、易受培养条件的影响。对未经培养的羊水间期细胞进培养条件的影响。对未经培养的羊水间期细胞进行荧光原位杂交检测行荧光原位杂交检测,快速诊断胎儿常见的三体快速诊断胎儿常见的三体型及性染色体数目异常型及性染色体数目异常,具有快速、简便、敏感、具有快速、简便、敏感、特异性强等优点。特异性强等优点。34荧光原位杂技技术和其临床应用FISH产前诊断技术临床应用价值产前诊断技术临床应用价值 正常情况下羊水失败率约为正常情况下羊水失败率约为0.

21、5%，超过妊娠超过妊娠24 周后培养失败率升至周后培养失败率升至10%。FISH 检测的成功检测的成功率率2002 年后陆续有大样本研究报道了较为一致的年后陆续有大样本研究报道了较为一致的成功率，约为成功率，约为95%98。后随着商品化探针的。后随着商品化探针的上市，操作程序规范化后失败率大大降低。传统上市，操作程序规范化后失败率大大降低。传统核型分析最少需要核型分析最少需要15 mL 羊水标本，而羊水标本，而FISH 只只需需35 mL 羊水。羊水。35荧光原位杂技技术和其临床应用FISH产前诊断技术在国外应用产前诊断技术在国外应用 FISH 技术最先在美国用于产前诊断，而到技术最先在美国用

22、于产前诊断，而到2000 年鉴于年鉴于FISH 技术具有高度的敏感性和特异技术具有高度的敏感性和特异性，美国医学遗传学会（性，美国医学遗传学会（ACMG）宣布）宣布FISH 技技术可以用于常见染色体数目异常的确诊。此后，术可以用于常见染色体数目异常的确诊。此后，FISH 技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊断。检测结果一般可以在断。检测结果一般可以在2448 h 就可以获得，就可以获得，且检测结果与核型分析结果的一致性可以达到且检测结果与核型分析结果的一致性可以达到99.5以上。以上。36荧光原位杂技技术和其临床应用FISH 与母源细胞污染与母源细胞污染

23、 羊膜腔穿刺时母源细胞污染可影响标羊膜腔穿刺时母源细胞污染可影响标本质量，导致误诊发生。建议发生严重母本质量，导致误诊发生。建议发生严重母血污染时不要进行血污染时不要进行FISH 检测。影响检测。影响FISH 结果的母体细胞来源羊膜腔穿刺中母体的结果的母体细胞来源羊膜腔穿刺中母体的淋巴细胞，淋巴细胞，这些细胞在体外培养时不会生这些细胞在体外培养时不会生长。出现母体细胞污染的原因很大程度上长。出现母体细胞污染的原因很大程度上与临床标本采集时操作有关。因此临床羊与临床标本采集时操作有关。因此临床羊膜腔穿过程中应尽量避开胎盘穿刺，对最膜腔穿过程中应尽量避开胎盘穿刺，对最初抽出的初抽出的24 mL 羊

24、水改行其他检测。羊水改行其他检测。38荧光原位杂技技术和其临床应用稽留流产与染色体异常稽留流产与染色体异常 孕早期胚胎染色体异常是稽留流产最重孕早期胚胎染色体异常是稽留流产最重要的原因的原因之一，自然流产中胚胎染色体异要的原因的原因之一，自然流产中胚胎染色体异常占常占50%左右，而胚胎染色体数目异常，包括整左右，而胚胎染色体数目异常，包括整倍体和非整倍体，为其发生的重要因素。倍体和非整倍体，为其发生的重要因素。39荧光原位杂技技术和其临床应用FISH应用于流产胚胎绒毛应用于流产胚胎绒毛 绒毛染色体检查是诊断胎儿染色体异常的可绒毛染色体检查是诊断胎儿染色体异常的可靠依据。由于绒毛染色体制备成功率

25、易受其取材靠依据。由于绒毛染色体制备成功率易受其取材时间及标本质量的影响，常造成标本分裂相少或时间及标本质量的影响，常造成标本分裂相少或染色体形态不佳等状况，给诊断带来困难。而染色体形态不佳等状况，给诊断带来困难。而FISH 分析无需作细胞培养及显带分析，仅作细胞分析无需作细胞培养及显带分析，仅作细胞计数，其优势是不仅适用于分裂中期的染色体，计数，其优势是不仅适用于分裂中期的染色体，也适用于间期核及细胞周期的所有阶段。也适用于间期核及细胞周期的所有阶段。40荧光原位杂技技术和其临床应用FISH应用于流产胚胎绒毛应用于流产胚胎绒毛 选用选用13、16、18、21、22、X和和Y染色体上染色体上的

26、探针对未培养的绒毛组织进行荧光原位杂交来诊的探针对未培养的绒毛组织进行荧光原位杂交来诊断染色体异常，杂交信号明亮断染色体异常，杂交信号明亮,敏感度高敏感度高,特异性特异性强，克服了流产绒毛组织易污染导致细胞培养不成强，克服了流产绒毛组织易污染导致细胞培养不成功，核型分析困难等导致结果难出的尴尬局面。功，核型分析困难等导致结果难出的尴尬局面。41荧光原位杂技技术和其临床应用FISH应用于流产胚胎绒毛应用于流产胚胎绒毛 胎儿自身的遗传学异常才是导致早期流产胎儿自身的遗传学异常才是导致早期流产的主要原因，绒毛染色体的主要原因，绒毛染色体FISH分析可对自然流分析可对自然流产的原因及时作出遗传学方面的

27、判断，尤其是产的原因及时作出遗传学方面的判断，尤其是对高危因素的流产绒毛常规行染色体对高危因素的流产绒毛常规行染色体FISH检测检测是有必要的。对习惯性自然流产的高危因素及是有必要的。对习惯性自然流产的高危因素及其临床绒毛染色体的分析研究，不仅能够为稽其临床绒毛染色体的分析研究，不仅能够为稽留流产的病因学研究提供理论依据，而且对患留流产的病因学研究提供理论依据，而且对患者再次妊娠的治疗也具有指导作用，因此开展者再次妊娠的治疗也具有指导作用，因此开展流产胚胎绒毛组织的流产胚胎绒毛组织的FISH染色体检查是相当有染色体检查是相当有意义的。意义的。42荧光原位杂技技术和其临床应用流产胚胎绒毛流产胚胎

28、绒毛FISH图图16号染色体探针信号三个（绿色）22号染色体探针信号三个（红色）43荧光原位杂技技术和其临床应用流产胚胎绒毛流产胚胎绒毛FISH图图13号染色体探针信号三个（绿色）21号染色体探针信号三个（红色）44荧光原位杂技技术和其临床应用流产胚胎绒毛流产胚胎绒毛FISH图图18号染色体探针信号号染色体探针信号2个（蓝色）个（蓝色）X染色体探针信号染色体探针信号1个（绿色）个（绿色）Y染色体探针信号染色体探针信号1个（红色）个（红色）45荧光原位杂技技术和其临床应用FISH技术在外周血临床应用技术在外周血临床应用 传统核型分析可发现染色体数传统核型分析可发现染色体数量异常和长度达量异常和长

29、度达5 Mb10Mb 的的结构性异常。因此传统核型分析已结构性异常。因此传统核型分析已经到达了检测的极限。经到达了检测的极限。46荧光原位杂技技术和其临床应用FISH技术在外周血临床应用技术在外周血临床应用 FISH 与常规的染色体显带分析法相比与常规的染色体显带分析法相比,快速、快速、不需体外培养、在极短的时间内分析的细胞数目不需体外培养、在极短的时间内分析的细胞数目比常规染色体分析数目多比常规染色体分析数目多10 倍，更容易检测出嵌倍，更容易检测出嵌合体类型，做出的结论更加准确。还可辅助及确合体类型，做出的结论更加准确。还可辅助及确定对一部分显带染色体技术不易分辨的结构异常定对一部分显带染

30、色体技术不易分辨的结构异常的确切诊断。例如的确切诊断。例如:额外的微小标记染色体及亚额外的微小标记染色体及亚带水平上的微小片段的重复、易位、插入、缺失带水平上的微小片段的重复、易位、插入、缺失等。等。47荧光原位杂技技术和其临床应用FISH图图46,XY,t(11;22)(q23;q11)用用22号染色体探针（绿色）号染色体探针（绿色）48荧光原位杂技技术和其临床应用FISH图图46,XY,t(13;22)(q12；q11)用用22号染色体探针（绿色）号染色体探针（绿色）49荧光原位杂技技术和其临床应用FISH在细胞遗传学应用小结在细胞遗传学应用小结 随着我国自行合成标记探针种类的增加、随着我国自行合成标记探针种类的增加、价格的降低，价格的降低，FISH 技术对染色体异常导致的出生技术对染色体异常导致的出生缺陷的快速产前诊断、流产胚胎染色体缺陷的快速产前诊断、流产胚胎染色体异常异常的查因的查因及显带技术不易分辨的结构异常的确切诊断方面将及显带技术不易分辨的结构异常的确切诊断方面将会在各地会在各地普及推广普及推广，在临床治疗及研究中将会发在临床治疗及研究中将会发挥更重要的作用。挥更重要的作用。50荧光原位杂技技术和其临床应用