斑蝥临床应用及炮制研究课件.ppt
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- 斑蝥 临床 应用 炮制 研究 课件
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1、1斑蝥临床应用及炮制研究斑蝥临床应用及炮制研究20102010版中国药典饮片标准研究课题版中国药典饮片标准研究课题 中药饮片质量标准平台建设子课题中药饮片质量标准平台建设子课题河南中医学院河南中医学院 张振凌张振凌 赵丽娜赵丽娜 王一硕王一硕 田连起田连起 石延榜石延榜 2概述斑蝥入药始载于神农本斑蝥入药始载于神农本草经,为芫青科昆虫南草经,为芫青科昆虫南方大斑蝥方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑或黄黑小斑蝥小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体的干燥体1。辛、热;有大毒。具有破辛、热;有大毒。具有破血消癥,攻毒蚀疮,引赤血消癥,攻
2、毒蚀疮,引赤发泡的作用。发泡的作用。由于斑蝥素具有毒性,常由于斑蝥素具有毒性,常引起临床中毒,从古至今引起临床中毒,从古至今均需要炮制均需要炮制3主主 要要 内内 容容斑蝥临床应用研究斑蝥临床应用研究1斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究3斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究4 斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究7斑蝥药材及饮片质量标准的研究斑蝥药材及饮片质量标准的研究5碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究61斑蝥米炒炮制工艺的研究斑蝥米炒炮制工艺的研究241.临床应用及药理研究临床应
3、用及药理研究含有的斑蝥素含有的斑蝥素(Cantharidin,C10H12O4)具有较强具有较强的抗肿瘤活性,并且不降低白细胞,同时具有较强的抗肿瘤活性,并且不降低白细胞,同时具有较强的刺激;是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药的刺激;是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药用价值用价值。1.1、治疗癌症、治疗癌症 斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性肝癌疗效显著,明显优于手术治疗或放疗。肝癌疗效显著,明显优于手术治疗或放疗。斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、等也有一定疗效。贲门
4、癌、肠癌、等也有一定疗效。1.2、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬 外用刺激皮肤发泡外用刺激皮肤发泡52.药理研究药理研究2.1抗肿瘤机制抗肿瘤机制 斑蝥素及其衍生物,分子量小,易入细胞内,产生细胞毒作用,具有较斑蝥素及其衍生物,分子量小,易入细胞内,产生细胞毒作用,具有较强的抗肿瘤作用,作用机制主要有:强的抗肿瘤作用,作用机制主要有:抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡;抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡;抑制肿瘤细胞的侵袭和转移;抑制肿瘤细胞的侵袭和转移;抑制癌细胞脱氧核糖核酸抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)复制,增加放、化疗的敏感性。并且具复制,增加放、化疗的
5、敏感性。并且具有免疫增强和升高白细胞作用,这种独特的作用,早期可能由加速骨髓有免疫增强和升高白细胞作用,这种独特的作用,早期可能由加速骨髓成熟或释放所致,后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖成熟或释放所致,后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖细胞不断分化有关。细胞不断分化有关。2.2 抗纤维化和抗氧化损伤作用:抗纤维化和抗氧化损伤作用:不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态,抑制细胞增殖,成纤维不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态,抑制细胞增殖,成纤维细胞数目明显下降,形态变得不规则,排列混乱,代谢产物增加。从而细胞数目明显下降,形态变得不规则,排列混乱,代谢产物增加
6、。从而证实斑蝥素能抑制证实斑蝥素能抑制NIH/373细胞的增殖,并且呈剂量依赖性。细胞的增殖,并且呈剂量依赖性。2.3 抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用。抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用。6第二部分第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究斑蝥米炒炮制工艺的研究05版中国药典规定米斑蝥的版中国药典规定米斑蝥的炮制方法为取炮制方法为取净斑蝥与米拌炒,净斑蝥与米拌炒,至米呈黄棕色,取出,除去头、至米呈黄棕色,取出,除去头、翅、足。翅、足。斑蝥为毒性中药,斑蝥为毒性中药,该炮制方法较该炮制方法较为笼统,仅靠颜色对炮制程度进为笼统,仅靠颜色对炮制程度进行判断,没有量化具体的工艺参行判断,没有量化具体的工艺参
7、数数,饮片企业很难按此生产出安,饮片企业很难按此生产出安全、可控、稳定的产品。全、可控、稳定的产品。根据传统的炮制根据传统的炮制经验,结合现代经验,结合现代炮制设备,炮制设备,量化量化斑蝥米炒炮制工斑蝥米炒炮制工艺的参数,进行艺的参数,进行中试生产,制定中试生产,制定SOP,符合中药,符合中药现代化的要求现代化的要求。7米斑蝥标准操作米斑蝥标准操作规程规程SOPSOP入锅入锅温度温度 200同时入锅同时入锅炒制炒制24min米呈黄棕色、米斑蝥完好米呈黄棕色、米斑蝥完好红外测温仪红外测温仪滚筒滚筒内壁内壁温度温度300铁锅铁锅电加热炒药机电加热炒药机大米炒制大米炒制2min后,后,入斑蝥炒制入斑
8、蝥炒制3min8米炒斑蝥米炒斑蝥SOPSOP1 1 适用范围适用范围本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。2 2 职责职责操作工:严格按本操作工:严格按本SOPSOP进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。3 3 内容内容3.1 3.1 生斑蝥、米炒斑蝥前的准备生斑蝥、米炒斑蝥前的准备3.1.13.1.1称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状态,生产用具齐全。态,生产用具齐全。3.1.23.1.2工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求。工作间压差、温度、相对湿度符合生
9、产工艺要求。3.1.33.1.3以上要求均满足后,方可生产。以上要求均满足后,方可生产。3.2 3.2 领料领料 操作人员领取斑蝥、大米,核对品名、数量等。如有不符,严操作人员领取斑蝥、大米,核对品名、数量等。如有不符,严禁进入生产岗位,并按相关规定处理。禁进入生产岗位,并按相关规定处理。3.3 3.3 净制:净制:操作人员将斑蝥过操作人员将斑蝥过2 2号筛,筛除杂质,去除头、足、翅,即为生号筛,筛除杂质,去除头、足、翅,即为生斑蝥。斑蝥。3.4 3.4 称量:称量:称取生斑蝥(除头、足、翅)称取生斑蝥(除头、足、翅)250g,250g,根据生斑蝥每根据生斑蝥每10kg10kg用大米用大米2k
10、g2kg,称取大米,称取大米50g50g。3.5 3.5 米炒:米炒:将电热将电热炒药机温度设定在炒药机温度设定在400400,开机,用红外测温仪监测滚筒开机,用红外测温仪监测滚筒内壁底温度,待内壁底温度,待滚筒内壁温度升至滚筒内壁温度升至300300,立即投入大米,并开,立即投入大米,并开始计时,将大米炒始计时,将大米炒2min2min后立即投入生斑蝥,继续炒制后立即投入生斑蝥,继续炒制3min3min,停停止炒制,立即出锅,此时大米为棕黄色,放凉。拣去大米。炒止炒制,立即出锅,此时大米为棕黄色,放凉。拣去大米。炒制过程共制过程共5min5min,用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在,用红外测
11、温仪监测滚筒内壁温度范围在280-280-320320。3.6 3.6 称量:称重米斑蝥,计算收率。称量:称重米斑蝥,计算收率。3.7 3.7 包装:将米斑蝥定量包装,贴上标签,注明品名、批号、包装:将米斑蝥定量包装,贴上标签,注明品名、批号、生产日期等。生产日期等。3.8 3.8 清场:生产操作完毕,及时清场,将垃圾妥善处理,确保清场:生产操作完毕,及时清场,将垃圾妥善处理,确保现场没有残留物。现场没有残留物。米炒斑蝥米炒斑蝥SOP9验证验证 由浙江中医药大学中药饮片厂生产出由浙江中医药大学中药饮片厂生产出9 9批批样品样品,说明本操作规程可行。,说明本操作规程可行。10第三部分第三部分 斑
12、蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究近年来相继近年来相继有多篇文章有多篇文章 报道了采用报道了采用HPLCHPLC法测定法测定斑蝥素含量斑蝥素含量 缺点:准确缺点:准确度不高,重度不高,重现性差,使现性差,使用不普及用不普及建立斑蝥建立斑蝥素的素的HPLCHPLC含量测定含量测定方法方法 20052005版药版药典收载斑典收载斑蝥素的含蝥素的含量测定方量测定方法为法为GCGC法法11斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究 药材药材 大、小净斑蝥大、小净斑蝥 根据根据大小斑蝥的特征大小斑蝥的特征进行挑拣,分档,除去杂质,进行
13、挑拣,分档,除去杂质,其中一份除去头、足、翅,即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉,备其中一份除去头、足、翅,即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉,备用。用。头、足、内外翅头、足、内外翅 因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离,因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离,故选故选大斑蝥进行各部位的剥离,大斑蝥进行各部位的剥离,粉碎成粗粉,备用。粉碎成粗粉,备用。米炒斑蝥米炒斑蝥 取净斑蝥与米置锅内,用文火加热,拌炒至米呈黄棕取净斑蝥与米置锅内,用文火加热,拌炒至米呈黄棕色,取出,去米。每色,取出,去米。每100g100g斑蝥,用米斑蝥,用米20g20g。规定药材温度规定药材温度110110,加热加热2min2min。
14、粉碎成粗粉,备用。粉碎成粗粉,备用。12斑蝥各部位重量比例表斑蝥各部位重量比例表样品样品头重头重%足重足重%内翅内翅重重%外翅重外翅重%头、足、翅总头、足、翅总重重%胸腹部胸腹部重重%1 15.805.808.278.271.951.9513.1913.1929.2129.2169.6269.622 25.815.819.169.161.581.5810.2510.2526.8026.8071.8271.823 36.196.197.367.362.272.2712.6312.6328.4528.4570.5270.524 45.635.637.357.351.741.7410.2610.26
15、24.9824.9874.3174.315 55.425.428.388.381.781.7810.2210.2225.8025.8073.7973.796 67.397.3911.2411.242.262.2611.3311.3332.2232.2266.7966.797 77.967.968.178.172.312.3111.8911.8930.3330.3367.8867.88平均重量平均重量比例比例%6.316.318.568.561.981.9811.4011.4028.2628.2670.6870.6813含量测定结果含量测定结果 斑蝥中斑蝥中头足翅总重仅占头足翅总重仅占28.26
16、%28.26%,而其所含,而其所含斑蝥素在斑蝥素在生品中占生品中占0.16%0.16%,且头足翅很,且头足翅很难完全粉碎,临床不去头足难完全粉碎,临床不去头足翅易引起病人恶心呕吐,故翅易引起病人恶心呕吐,故可以可以认为其为非药用部位。认为其为非药用部位。通过比较可知,通过比较可知,斑蝥素斑蝥素含量:生斑蝥饮片斑蝥药含量:生斑蝥饮片斑蝥药材米炒斑蝥。材米炒斑蝥。这说明这说明米炒米炒炮制使斑蝥中的斑蝥素含量炮制使斑蝥中的斑蝥素含量减少,毒性降低,减少,毒性降低,同时由于同时由于头足翅中斑蝥素含量较低,头足翅中斑蝥素含量较低,导致同等重量下斑蝥药材中导致同等重量下斑蝥药材中的含量低于生斑蝥饮片中斑的
17、含量低于生斑蝥饮片中斑蝥素含量。蝥素含量。南方大斑蝥和黄黑小斑南方大斑蝥和黄黑小斑蝥中斑蝥素含量相差不明显,蝥中斑蝥素含量相差不明显,故可将两者一起炮制。故可将两者一起炮制。14第四部分第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆虫中含有的斑蝥素分为虫中含有的斑蝥素分为游离和结合两部分游离和结合两部分,并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量。并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量。05版药典规定的氯仿直接浸提法,没有得到总斑蝥素的含量 结合斑蝥素在结合斑蝥素在酸水解条件下酸水解条件下还原为游离
18、的还原为游离的斑蝥素斑蝥素通过预试验,证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的通过预试验,证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的游离斑蝥素,还含有酸水解提取的结合斑蝥素。游离斑蝥素,还含有酸水解提取的结合斑蝥素。药材及饮片中药材及饮片中总斑蝥素的研究总斑蝥素的研究15总斑蝥素总斑蝥素提取方法的考察提取方法的考察0.5mol/LH0.5mol/LH2 2SOSO4 4溶溶液调液调PHPH至至2 2左右左右样品粗样品粗粉粉0.4g0.4g蒸馏水蒸馏水10ml10ml提取液提取液上清液上清液离心离心7070水浴水浴加热加热30min30min酸液酸液至分液漏斗至分液漏斗至蒸发皿至蒸发皿5050水浴挥干水浴挥干甲醇定容至甲
19、醇定容至5ml容量瓶容量瓶超声超声15min15min氯仿萃取氯仿萃取4 4次次第一第一法法16超声处理超声处理1515分钟分钟静置静置26h26h样品粗样品粗粉粉0.4g0.4g三氯甲烷三氯甲烷10ml10ml提取液提取液至分液漏斗至分液漏斗至蒸发皿至蒸发皿5050水浴挥干水浴挥干甲醇定容至甲醇定容至5ml容量瓶容量瓶盐酸溶液(盐酸溶液(PH=1PH=1)10ml10ml氯仿萃取氯仿萃取4 4次次静置静置26h26h超声处理超声处理1515分钟分钟第二法第二法第三法第三法第四法第四法17结果结果 将上述四种方法所得供试品溶液,按色谱条件进样,将上述四种方法所得供试品溶液,按色谱条件进样,计算
20、各样品中总斑蝥素的含量。计算各样品中总斑蝥素的含量。提取方法提取方法第一法第一法第二法第二法第三法第三法第四法第四法总斑蝥素含量总斑蝥素含量(%)1.371.371.601.601.601.601.611.61 为使斑蝥素转移完全,对该法中三氯甲烷的萃取次数为使斑蝥素转移完全,对该法中三氯甲烷的萃取次数及洗涤次数进行考察,结果表明,萃取五次和洗涤五次转及洗涤次数进行考察,结果表明,萃取五次和洗涤五次转移完全。移完全。按照该法对药渣进行提取,提取液中未检测到斑蝥素,按照该法对药渣进行提取,提取液中未检测到斑蝥素,表明提取完全。表明提取完全。18第四法正交设计实验考察第四法正交设计实验考察水平水平
21、因素因素A A盐酸盐酸PHPHB B超声功率超声功率(W)(W)C C 超声时间超声时间(minmin)D D 三氯甲烷用量三氯甲烷用量(mlml)1 12 23 3PH=1PH=1PH=2PH=2PH=3PH=3300 300 400400500500101015152020101020203030因素水平表因素水平表 通过预试验,分别对通过预试验,分别对盐酸盐酸PHPH值、超声功率、超声时间、值、超声功率、超声时间、三氯甲烷用量三氯甲烷用量四个因素,选用四个因素,选用L L9 9(3 34 4)正交试验表对酸水解)正交试验表对酸水解超声法提取工艺进行筛选优化。超声法提取工艺进行筛选优化。1
22、9总斑蝥素提取方法总斑蝥素提取方法L L9 9(3 34 4)正交实验及实验结果)正交实验及实验结果 实验实验号号因因 素素总斑蝥素含量总斑蝥素含量(%)A A盐酸盐酸PHPH值值B B超声功率超声功率(W)(W)C C超声时间超声时间(minmin)D D三氯甲烷用量三氯甲烷用量(mlml)1 11 1(PH=1)(PH=1)1(1(300W)300W)1(1(10min)10min)1(1(10ml)10ml)1.321.322 21 12(2(400W)400W)2(2(15min)15min)2(2(20ml)20ml)1.291.293 31 13(3(500W)500W)3(3(2
23、0min)20min)3(3(30ml)30ml)1.511.514 42 2(PH=2)(PH=2)1 12 23 31.431.435 52 22 23 31 11.001.006 62 23 31 12 21.311.317 73 3(PH=3)(PH=3)1 13 32 20.390.398 83 32 21 13 30.440.449 93 33 32 21 10.410.41K1K14.12 4.12 3.14 3.14 3.07 3.07 2.73 2.73 K2K23.74 3.74 2.73 2.73 3.13 3.13 2.99 2.99 K3K31.24 1.24 3.2
24、3 3.23 2.90 2.90 3.38 3.38 SjSj1.63 1.63 0.05 0.05 0.01 0.01 0.07 0.07 总和总和9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.109.1020方方 差差 分分 析析 表表 方差来源方差来源离差平方和离差平方和自由度自由度均值均值F F值值显著性显著性A A1.6321 1.6321 2 2 0.8160 0.8160 172.00 172.00*B B0.0474 0.0474 2 2 0.0237 0.0237 4.99 4.99 D D0.0714 0.0714 2 2 0.0357
25、 0.0357 7.52 7.52 误差误差C C0.0095 0.0095 2 2 0.0047 0.0047 综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为:综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为:A A1 1B B2 2C C2 2D D1 1。即:取三氯甲烷和即:取三氯甲烷和 PH=1 PH=1的盐酸溶液各的盐酸溶液各10ml10ml,超声,超声处理(功率处理(功率100W100W,频率,频率40kHz40kHz)1515分钟。分钟。21验证验证 分别取同批次斑蝥药材样品粗粉分别取同批次斑蝥药材样品粗粉0.3g0.3g各各3 3份,精密称份,精密称定,按优选的提取工艺提取总斑蝥素,定,按优选的提取工艺提取总斑
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