网织红细胞检测进展和其临床应用培训课件.ppt
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- 红细胞 检测 进展 临床 应用 培训 课件
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1、网织红细胞检测进展和其临床应用概述 网织红细胞网织红细胞(reticulocyte,Ret)是介于晚是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞,略幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞,略大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去核的阶段,仍属未完全成熟的红细胞,浆内失去核的阶段,仍属未完全成熟的红细胞,浆内尚残留有嗜碱性尚残留有嗜碱性RNA,经碱性染料(如天青,经碱性染料(如天青B、煌焦油蓝或新亚甲蓝)活体染色后,在包体内可煌焦油蓝或新亚甲蓝)活体染色后,在包体内可见蓝色点状或网状结构,故名网织红细胞。见蓝色点状或网状结构,故名网织红细胞。2
2、网织红细胞检测进展和其临床应用概述 红细胞在骨髓中生成,至发育为成熟红细胞,经红细胞在骨髓中生成,至发育为成熟红细胞,经历了不同阶段:干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中历了不同阶段:干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞,最后发育为成熟幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞,最后发育为成熟红细胞。随着细胞的成熟,红细胞。随着细胞的成熟,RNA含量逐渐减低,至细胞含量逐渐减低,至细胞完全成熟后消失或接近消失,即红细胞中网线状结构越完全成熟后消失或接近消失,即红细胞中网线状结构越多,表示细胞越幼稚。多,表示细胞越幼稚。ICSH(国际血液学标准委员会)(国际血液学标准委员会)将
3、将Ret分为分为4型:型:型(丝球型)、型(丝球型)、型(花冠型或网型(花冠型或网型)、型)、型(破网型)、型(破网型)、型(颗粒型)。正常生理状型(颗粒型)。正常生理状态下,态下,型只存在于骨髓,型只存在于骨髓,型在外周血也很难见到,型在外周血也很难见到,型仅有少量释放到外周血,因此外周血网织红细胞计型仅有少量释放到外周血,因此外周血网织红细胞计数时以数时以型为主。型为主。3网织红细胞检测进展和其临床应用4网织红细胞检测进展和其临床应用网织红细胞分型ICSHICSH将网织红细胞分类四型:将网织红细胞分类四型:IRF(未成熟网织红细胞比例未成熟网织红细胞比例)=HFR+MFRI I型(丝球型)
4、:红细胞几乎被网织物充满,此型亦仅见于正常骨髓中。型(丝球型):红细胞几乎被网织物充满,此型亦仅见于正常骨髓中。IIII型(网型):位于红细胞中央线团样结构,开始松散、此型大量存在于骨髓中。型(网型):位于红细胞中央线团样结构,开始松散、此型大量存在于骨髓中。型(破网型):网织结构稀小,呈不规律枝点状排列,外周血中可见少量。型(破网型):网织结构稀小,呈不规律枝点状排列,外周血中可见少量。IVIV型(颗粒型):胞浆中嗜碱物质很少,呈分散的细颗粒、短丝状,正常外周血型(颗粒型):胞浆中嗜碱物质很少,呈分散的细颗粒、短丝状,正常外周血中的网织细胞大多见于此型。中的网织细胞大多见于此型。nnnnnH
5、FRnMFRnLFR5网织红细胞检测进展和其临床应用网织红细胞检测进展1.手工法手工法2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪6网织红细胞检测进展和其临床应用1.手工法 手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发,染色时间偏短,因此结果偏低;试管法容易掌握,重复性分蒸发,染色时间偏短,因此结果偏低;试管法容易掌握,重复性较好,必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法较好,必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被列为手工法被列为手工法R
6、et计数的参考方法。按卫生部计数的参考方法。按卫生部全国临床检验操作规全国临床检验操作规程程第第2版,采用试管法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体版,采用试管法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片,选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处,每份染色、制片,选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处,每份标本油镜下标本油镜下,Ret6%,计数红细胞,计数红细胞1000个;个;3%5%计数红细计数红细胞胞2000个;个;1%2%应计数红细胞应计数红细胞4000个;小于个;小于1%计数红细胞计数红细胞10000个。个。7网织红细胞检测进展和其临床应用 网织细胞的活体染色:染色时间:28
7、min 比例:用2%的煌焦油兰染色以滴数计1:5时,网织细胞数开始减少,1:2为最佳.涂片部位:中部为佳.玻片干燥程度:立即干燥者最佳.普通光学显微镜法:计数1000个RBC中的Ret,以百分数表示.8网织红细胞检测进展和其临床应用 传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较多。近年来,国内开始使用国际血液学标准化委员会多。近年来,国内开始使用国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的推荐的Miller窥盘进行计数,规范了计算区域,减窥盘进行计数,规范了计算区域,减少了实验误差,使结果准确性有所提高少了实验误差,使结果准确性有所提高(卫生部临
8、检中心卫生部临检中心建议,建议,CV控制在控制在15%之内之内)。Miller窥盘法是将一种光学窥盘法是将一种光学圆片状圆片状Miller窥盘安放在显微镜目镜中,窥盘中有面积比窥盘安放在显微镜目镜中,窥盘中有面积比例为例为1:9的的2个正方形计数方格,只需计数个正方形计数方格,只需计数19小方格内小方格内的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量9网织红细胞检测进展和其临床应用 计算方法 1.Miller窥盘法:网织红细胞(窥盘法:网织红细胞(Retic)百分率百分率(%)=(大方格(大方格内内Retic总数)总数)/(小方格内(小方格内RBC
9、总数总数9)100%2.直接计数法:网织红细胞(直接计数法:网织红细胞(Retic)百分率百分率(%)=多个视野多个视野内内Retic总数总数/多个视野内多个视野内RBC总数总数100%10网织红细胞检测进展和其临床应用卫生部临床检验中心控制Ret计数CV15%需镜检的RBC数目11网织红细胞检测进展和其临床应用手工法网织红细胞活体染色染料评价12网织红细胞检测进展和其临床应用参考值成人:成人:0.005-0.015(0.5%-1.5%)新生儿:新生儿:0.02-0.06(2%-6%)儿童:儿童:0.005-0.075(0.5%-7.5%)成人绝对值成人绝对值(24-84)109/L 13网织
10、红细胞检测进展和其临床应用2.血细胞分析仪法 虽然仪器法虽然仪器法Ret计数有诸多优点,而且精密度明显计数有诸多优点,而且精密度明显优于手工法,但也存在一些不足优于手工法,但也存在一些不足:第一,所有仪器分析:第一,所有仪器分析的基本原理都是检测的基本原理都是检测Ret内内RNA 的存在量来决定其百分的存在量来决定其百分率和绝对值,当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异率和绝对值,当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异常增加时,可导致常增加时,可导致Ret计数结果的假性增加;第二,冷计数结果的假性增加;第二,冷凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或
11、药物都能使红细胞产生自身荧光;第三,自动化分析仪结果的准使红细胞产生自身荧光;第三,自动化分析仪结果的准确性除了依赖于仪器本身的良好性能外,还应有良好的确性除了依赖于仪器本身的良好性能外,还应有良好的质控物随时检测仪器的状态。另外,仪器成本高、价格质控物随时检测仪器的状态。另外,仪器成本高、价格贵,基层医疗单位投入较为困难。贵,基层医疗单位投入较为困难。14网织红细胞检测进展和其临床应用 说明:虽然大多数仪器都利用了流式细胞技术,但它们在应用的染料,检测技术方面还是有各自的特点.通常荧光的强度,光吸收量,和光散射量与网织细胞的RNA含量成正比.15网织红细胞检测进展和其临床应用仪器型号仪器型号
12、处理处理染色染色检测技术检测技术Bayer ADVIA 120活体Oxazine 750光吸收Bayer H*3活体Oxazine 750光吸收Abbott CellDyn CD3200活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD3500活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD3700活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD4000荧光CD4K 530荧光法Becton Dickison ReticCount FACSCount 荧光噻唑橙荧光法Beckman Coulter STKS活体新亚甲蓝VCSBeckman Coulter GENS活体新亚甲蓝VCSS
13、ysmex XE2100荧光聚次甲基荧光染料光散射ABX Pentra 120 Retic荧光噻唑橙光散射16网织红细胞检测进展和其临床应用3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 流式细胞仪流式细胞仪(flowcytometry,FCM)是一种多用是一种多用途的精密分析仪器,应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等途的精密分析仪器,应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等这些特殊的荧光染料与这些特殊的荧光染料与Ret中的中的RNA结合,当结合,当FCM 发发出的激光照射于细胞上时,根据细胞能否发射出特定出的激光照射于细胞上时,根据细胞能否发射出特定颜色的荧光,通过单参数定量测定颜色的荧光,通过单参数定量测定RNA,从
14、而精确测,从而精确测定定Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出的荧光强度,或光吸收量大小、光散射量多少等参出的荧光强度,或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对数的比例关系对Ret成熟程度进行分群,将其划分为低成熟程度进行分群,将其划分为低荧光强度网织红细胞荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞、高荧光强度网织红细胞(HFR)。17网织红细胞检测进展和其临床应用3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 FCM 测定精密度明显高于手工法测定精密度明显高于手工法36倍,倍,可
15、在数秒中检测可在数秒中检测20000个以上的红细胞,如个以上的红细胞,如Ret在在1.76.6%,其平均,其平均CV值在值在4.3%。不足之处,流式细胞仪计数不足之处,流式细胞仪计数Ret受受HOWELLJolly小体、疟原虫和血小板等干扰。小体、疟原虫和血小板等干扰。18网织红细胞检测进展和其临床应用6 6项网织红系参数项网织红系参数网织红细胞百分比网织红细胞百分比RET%RET%网织红细胞数网织红细胞数RET#RET#未成熟网织红细胞比例未成熟网织红细胞比例IRFIRF低荧光强度网织红细胞比率低荧光强度网织红细胞比率LFRLFR中荧光强度网织红细胞比率中荧光强度网织红细胞比率MFRMFR高
16、荧光强度网织红细胞比率高荧光强度网织红细胞比率HFRHFRRBCLFRMFRWBCPLT-OHFRRET%=RET#/RET%=RET#/RBC-ORBC-ORET#=RET#=RBC-ORBC-O*RET%RET%IRF=MFR+HFRIRF=MFR+HFRLFR=LFR#/RET#-OLFR=LFR#/RET#-OMFR=MFR#/RET#-OMFR=MFR#/RET#-OHFR=HFR#/RET#-OHFR=HFR#/RET#-O19网织红细胞检测进展和其临床应用l RET%-RET%-网织红细胞占全部红细胞的比率网织红细胞占全部红细胞的比率l RET#-RET#-网织红细胞绝对数目网织
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