第二十一章microRNA检测技术在临床的应用课件.ppt

1、 第二十一章第二十一章 microRNAmicroRNA检测技术在临床的应用检测技术在临床的应用miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能 miRNAmiRNA检测在肿瘤诊断中的应用检测在肿瘤诊断中的应用 上一页上一页下一页下一页返回返回 (miRNA是一类进化上保守的单链非编码小分子是一类进化上保守的单链非编码小分子RNA，定位于定位于RNA前体的前体的3端或端或5端，具有在翻译水平调控基端，具有在翻译水平调控基因表达的功能。因表达的功能。上一页上一页下一页下一页返回返回 （二）（二）miRNAmiRNA基本特征基本特征 1.1.结构特征结构特征 2.2.miRNAmiRNA的存在形式

2、的存在形式 3.3.保守性保守性 4.4.时空特异性时空特异性 上一页上一页下一页下一页返回返回 （三）不同生物的（三）不同生物的miRNAmiRNA特点特点 植物与动物植物与动物miRNAmiRNA的区别的区别 上一页上一页下一页下一页动物动物植物植物前体茎环结构前体茎环结构短，简单短，简单长，复杂，折回长度变长，复杂，折回长度变异明显异明显加工过程加工过程先在细胞核内，后再细先在细胞核内，后再细胞质胞质仅在细胞核内仅在细胞核内作用机制作用机制大部分作为翻译阻遏子，大部分作为翻译阻遏子，小部分导致靶小部分导致靶mRNAsmRNAs的的降解降解大部分介导靶大部分介导靶mRNAsmRNAs的的降

3、解降解长度长度21-23nt21-23nt21nt21nt保守性保守性高高更高更高返回返回 （四）（四）miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA的比较的比较 1.miRNA1.miRNA与与siRNAsiRNA相同之处相同之处 （1 1）二者的长度都约在）二者的长度都约在22nt22nt左右。左右。（2 2）二者都依赖）二者都依赖DicerDicer酶的加工，是酶的加工，是DicerDicer的产物，所以的产物，所以具有具有DicerDicer产物的特点产物的特点:5:5端磷酸，端磷酸，3 3端均有端均有2 2个游离核个游离核苷酸。苷酸。（3 3）miRNAmiRNA和和siRNAsiRN

4、A合成都是由双链的合成都是由双链的RNARNA或或RNARNA前体形成前体形成的。的。（4 4）二者都是）二者都是RNARNA诱导的基因沉默复合体诱导的基因沉默复合体 (RNA induced(RNA induced silencing complexsilencing complex，RISC)RISC)组分，都具有组成组分，都具有组成RISCRISC复合体复合体的的ArgonauteArgonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。者在介导沉默机制上有重叠。上一页上一页下一页下一页返回返回 （四）（四）miRNAmiRN

5、A与与siRNAsiRNA的比较的比较 2.miRNA2.miRNA和和siRNAsiRNA区别：区别：（1 1）根本区别是）根本区别是miRNAmiRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNAsiRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，。断和转座片断，病毒基因组转录片断等，。（2 2）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNARNA，miRNAmiRNA转录转录出来时必然是发夹状的，出来时必

6、然是发夹状的，siRNAsiRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。可以从发夹来。（3 3）本质区别在于作用位点上，）本质区别在于作用位点上，miRNAmiRNA作用于固定的靶基因，有特定作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因的作用位点，一般在靶基因3-UTR3-UTR区，而区，而siRNAsiRNA由于是随机产生的或由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNAmRNA的任何的任何部位。部位。（4 4）在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互）

7、在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，补程度，siRNAsiRNA也可抑制靶标基因的翻译。也可抑制靶标基因的翻译。（5 5）miRNAmiRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而表达，而siRNAsiRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。是抑制转座子活性和病毒感染。上一页上一页下一页下一页返回返回二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成 上一页上一

8、页下一页下一页1 1 miRNAmiRNA生物合成过程生物合成过程 在细胞核内，基因组在细胞核内，基因组DNA DNA 转录生成较长的转录生成较长的RNARNA分子（可长分子（可长达达1000nt1000nt），被双链），被双链RNA RNA 特异的核糖核酸酶特异的核糖核酸酶 DroshaDrosha 切割成切割成长度大约长度大约70-100 70-100 碱基的、具发夹结构的碱基的、具发夹结构的RNA RNA 分子（前体分子（前体 microRNAmicroRNA）。这些发夹结构的）。这些发夹结构的RNA RNA 通过核输出蛋白通过核输出蛋白exportin5 exportin5 机制转运到

9、细胞质，然后被第二个双链机制转运到细胞质，然后被第二个双链 RNA RNA 特特异的核糖核酸酶异的核糖核酸酶Dicer Dicer 切割，得到切割，得到19-23nt 19-23nt 大小的成熟的大小的成熟的miRNAsmiRNAs 产物。产物。返回返回二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成 上一页上一页下一页下一页 miRNAmiRNA生物合成过程生物合成过程 返回返回二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（一）（一）miRNAmiRNA生物合成生物合成 上一页上一页下一页下一页2 2 miRNAmiRNA在

10、基因组分布在基因组分布 独立表达的独立表达的miRNAs 成簇表达的成簇表达的miRNAs 位于内含子的位于内含子的miRNAs 返回返回二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（二）（二）miRNAmiRNA 生物学功能生物学功能1.miRNA1.miRNA调控基因表达机制调控基因表达机制 上一页上一页下一页下一页miRNAmiRNA调控基因表达两种机制调控基因表达两种机制 miRNAmiRNA调控蛋白翻译调控蛋白翻译 miRNAmiRNA调控调控mRNAmRNA降解降解返回返回 二、二、miRNAmiRNA生物合成与功能生物合成与功能（二）（二）miRNAmiRNA 生物学

11、功能生物学功能 2.2.miRNAmiRNA调控基因表达的特征与优点调控基因表达的特征与优点（1 1）miRNAmiRNA调控基因表达的特点调控基因表达的特点 1）交叉调节;2）自我调节;3）可逆性调节.（2 2）miRNAmiRNA调控基因表达的优点调控基因表达的优点 1）与蛋白水平的调节相比，更加节省能量 2）与转录水平调节相比，miRNA 调节更迅速，而且是可逆的 3）内含子所编码的 miRNA 是一种对基因组资源的高效利用上一页上一页下一页下一页返回返回三三miRNAmiRNA应用应用（一）基因功能的分析（一）基因功能的分析（二）（二）miRNAmiRNA 功能和效应的评价功能和效应的

12、评价（三）（三）新型基因治疗方案的设计和发展新型基因治疗方案的设计和发展（四）抗病毒疫苗的设计和研制（四）抗病毒疫苗的设计和研制（五）功能缺失转基因动物的建立（五）功能缺失转基因动物的建立上一页上一页下一页下一页返回返回一、理想的一、理想的miRNAmiRNA检测与定量方法检测与定量方法miRNAmiRNA检测检测 1.1.具有足够的灵敏性检测到少量的具有足够的灵敏性检测到少量的miRNAmiRNA；2.2.具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的 miRNAmiRNA；3.3.能够进行能够进行miRNAmiRNA表达的定量分析；表达的定量分析；4.4.进行

13、多样本平行检测；检测过程简便、经济。进行多样本平行检测；检测过程简便、经济。上一页上一页下一页下一页返回返回 二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（一）基因芯片技术（一）基因芯片技术 miRNAmiRNA microarray microarray可以检测组织特异的可以检测组织特异的miRNAmiRNA,并且实并且实验结果可重复率高。这种微芯片不仅可以检测验结果可重复率高。这种微芯片不仅可以检测miRNAmiRNA的类的类型型,还可以对其进行定量。它可以一次在同一样本中检测还可以对其进行定量。它可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达出几百个基因的

14、全部表达;通过设计适当的寡核苷酸探针通过设计适当的寡核苷酸探针,同时检测成熟的同时检测成熟的miRNAmiRNA及其前体分子及其前体分子;miRNAmiRNA microarray microarray可以用于高通量的筛选可以用于高通量的筛选miRNAmiRNA,并且可以用于临床病例的筛并且可以用于临床病例的筛选。选。上一页上一页下一页下一页返回返回二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（一）基因芯片技术（一）基因芯片技术上一页上一页下一页下一页基因芯片技术检测基因芯片技术检测 miRNAmiRNA表达的基本原理表达的基本原理返回返回二、几种常用二、几种常

15、用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（二）荧光定量技术（二）荧光定量技术 实时定量逆转录实时定量逆转录PCRPCR可用于检测可用于检测miRNAmiRNA的表达水平。的表达水平。Step-loopStep-loop实时定量是一项高特异度、敏感度的检测实时定量是一项高特异度、敏感度的检测miRNAmiRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（表达的实验技术，包括设计具有茎环（stem loopstem loop）结构）结构的反转录引物和用的反转录引物和用miRNAmiRNA荧光标记的特异分子探针进行实荧光标记的特异分子探针进行实时时PCR 2PCR 2个关键步骤。该技术有以下优点

16、：高度特异性，个关键步骤。该技术有以下优点：高度特异性，特异的特异的step-loop step-loop 反转录引物和探针确保反应不受其前体反转录引物和探针确保反应不受其前体及基因组及基因组DNADNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNAmiRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7 7个数量级个数量级 上一页上一页下一页下一页返回返回Step-loop Step-loop 反转录反转录PCRPCR检测

17、检测miRNAmiRNA基本原理基本原理上一页上一页下一页下一页返回返回二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（三）克隆测序技术（三）克隆测序技术 大多数现有的大多数现有的miRNAmiRNA是通过是通过cDNAcDNA克隆识别和鉴定出来克隆识别和鉴定出来的的,这是发现这是发现miRNAmiRNA的重要方法。构建的重要方法。构建miRNAmiRNA的的cDNAcDNA文库通文库通常有两种方法常有两种方法,一种是将所有的一种是将所有的RNARNA通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离回收离回收25nt25nt以下的小片段以下的小片段RNA

18、,RNA,随后在随后在RNA3RNA3和和55端连上端连上接头接头,逆转录后与对应引物进行逆转录后与对应引物进行PCRPCR扩增扩增,再将片段克隆至再将片段克隆至载体载体,最后对每个克隆进行测序。最后对每个克隆进行测序。第二种方法是分离出小片段第二种方法是分离出小片段RNARNA后后,用用poly(Apoly(A)聚合酶在聚合酶在33端进行多聚腺苷酸化反应端进行多聚腺苷酸化反应,逆转录后逆转录后,再在再在cDNA3cDNA3端端进行鸟苷酸化反应进行鸟苷酸化反应,随后进行扩增和测序随后进行扩增和测序,最后通过最后通过PAGE/Northern blotPAGE/Northern blot等予以验

19、证。等予以验证。上一页上一页下一页下一页返回返回 上一页上一页下一页下一页克隆测序技术进行克隆测序技术进行miRNAmiRNA检测的基本原理检测的基本原理 返回返回二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法 （四）原位杂交技术（四）原位杂交技术 原位杂交原位杂交(In situ hybridization)(In situ hybridization)检测检测miRNAsmiRNAs逐逐渐发展起来渐发展起来,它可以检测候选它可以检测候选miRNAsmiRNAs的短暂表达的短暂表达 。应用原。应用原位杂交技术可进行石蜡包埋、福尔马林固定的组织内的位杂交技术可进行

20、石蜡包埋、福尔马林固定的组织内的miRNAmiRNA检测，同时可以不再分离检测，同时可以不再分离miRNAmiRNA情况下，进行多细胞情况下，进行多细胞之间之间miRNAmiRNA表达的检测表达的检测 。上一页上一页下一页下一页返回返回上一页上一页下一页下一页原位杂交方法检测原位杂交方法检测miRNAmiRNA的基本原理的基本原理 返回返回二、几种常用二、几种常用miRNAmiRNA检测与定量的方法检测与定量的方法（五）（五）NorthernNorthern杂交技术杂交技术 RNARNA印迹即印迹即Northern blotNorthern blot是最经典的检测真核生物是最经典的检测真核生物

21、RNARNA的量和大小及估计其丰度的实验方法的量和大小及估计其丰度的实验方法,可以从大量的可以从大量的RNARNA样本中同时获得这些信息样本中同时获得这些信息,主要包括主要包括:完整的完整的RNARNA的的分离分离;根据根据RNARNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNARNA进行分进行分离离;将将RNARNA转移到固相支持物上转移到固相支持物上,在转移过程中在转移过程中,要保持要保持RNARNA在凝胶中的相对分布在凝胶中的相对分布;将将RNARNA固定到固体支持物上固定到固体支持物上;固相固相RNARNA与探针分子杂交与探针分子杂交;除去非特异结合到固相支持除去非特异结

22、合到固相支持物上的探针分子物上的探针分子;对特异结合的探针分子的图像进行检对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。测、捕获和分析。上一页上一页下一页下一页返回返回上一页上一页下一页下一页NorthernNorthern杂交技术进行杂交技术进行miRNAmiRNA检测的基本原理图检测的基本原理图 返回返回上一页上一页下一页下一页一一 、miRNAmiRNA检测在肿瘤诊断中的应用检测在肿瘤诊断中的应用 最近的研究发现，最近的研究发现，miRNAmiRNA表达与多种癌症相关，大约表达与多种癌症相关，大约50%50%得到注解的得到注解的miRNAsmiRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆在基

23、因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（性位点（fragile sitefragile site）。这说明）。这说明miRNAsmiRNAs在肿瘤发生过程在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些中起至关重要的作用，这些miRNAsmiRNAs所起的作用类似于抑癌所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNAmiRNA命名为命名为“ONCOMIRsONCOMIRs”。对患者进行的有关。对患者进行的有关oncomiRoncomiR的大型高通量的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的

24、预测。准确的预测。返回返回上一页上一页下一页下一页一一 、miRNAmiRNA检测在肿瘤诊断中的应用检测在肿瘤诊断中的应用（一）（一）microRNAmicroRNA与癌症产生与癌症产生 MicroRNAsMicroRNAs诱发肿瘤的机制诱发肿瘤的机制 返回返回上一页上一页下一页下一页一一 、miRNAmiRNA检测在肿瘤诊断中的应用检测在肿瘤诊断中的应用（二）（二）oncoMIRoncoMIR的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关研究展、诊断、预后相关研究 miRNAmiRNA 表达水平的变化表达水平的变化,导致了肿瘤基因或抑癌导致了肿

25、瘤基因或抑癌基因转录后的异常调控基因转录后的异常调控,从而导致肿瘤的发生。通过从而导致肿瘤的发生。通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNAmiRNA,可以为肿瘤可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。的诊断和生物治疗提供新的靶标。返回返回上一页上一页下一页下一页各种肿瘤组织内各种肿瘤组织内miRNA表达以及与预后的相关性表达以及与预后的相关性 肿瘤类型miRNASmiRNAS表达情况检测方法与预后的关系脑肿瘤miR-21升高升高Northern 杂交杂交 不清楚不清楚miR-221，miR-10b升高升高芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交miR-128

26、，miR-181a降低降低芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交乳腺癌miR-21升高升高芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交miR-21与与miR-145表达水平与肿表达水平与肿瘤增殖指数具有瘤增殖指数具有相关性相关性miR-125b,miR-145降低降低芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交结直肠肿瘤miR-143，miR-145miR-133b降低降低Northern 杂交杂交miR-31表达水平表达水平与肿瘤的分期有与肿瘤的分期有关关miR-31,miR-95,miR-135b,miR-183升高升高定量定量PCR检测检测返回返回上一页上一页下一页下一页各种肿瘤组织内各

27、种肿瘤组织内miRNA表达以及与预后的相关性表达以及与预后的相关性 肿瘤类型miRNASmiRNAS表达情况检测方法与预后的关系非小细胞肺癌let7降低降低芯片杂交芯片杂交定量定量PCR检测检测Let7的低表达与的低表达与miR-155高表达预高表达预示预后不佳示预后不佳miR-126降低降低芯片杂交芯片杂交定量定量PCR检测检测miR-21，miR-205，miR-155升高升高芯片杂交芯片杂交定量定量PCR检测检测肝细胞肿瘤miR-18，miR-224升高升高芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交miR-18表达水平表达水平与肿瘤分化成负相与肿瘤分化成负相关关miR-199a,miR-

28、195,miR-200a,miR-125a降低降低芯片杂交芯片杂交Northern 杂交杂交甲状腺滤泡癌miR-197,miR-346升高升高芯片杂交芯片杂交定量定量PCR检测检测生殖细胞肿瘤miR-372,miR-373升高升高原位杂交原位杂交返回返回上一页上一页下一页下一页二二 、miRNAmiRNA检测在心血管系统疾病诊断中应用检测在心血管系统疾病诊断中应用 目前有关目前有关miRNA在心脏病理生理过程的调节作用的研在心脏病理生理过程的调节作用的研究已经取得一些进展。在心脏的发生发育与分化的调节方究已经取得一些进展。在心脏的发生发育与分化的调节方面，小分子面，小分子RNA能帮助精确调节与

29、心脏肌肉初期发育有关能帮助精确调节与心脏肌肉初期发育有关的关键蛋白的生产；如的关键蛋白的生产；如miR-1能够靶向能够靶向Hand2基因的基因的mRNA，而，而Hand2基因是心脏形成的一种关键调节因子。基因是心脏形成的一种关键调节因子。小分子小分子RNA适时地关闭适时地关闭Hand2蛋白的生成以促使心肌正蛋白的生成以促使心肌正常发育。同时，常发育。同时，miR-1也是肌细胞的分化调节因子的直接也是肌细胞的分化调节因子的直接作用靶点。研究发现，在心脏的肥大过程中，作用靶点。研究发现，在心脏的肥大过程中，miR-195,miR-133a,miR-125等等12种种microRNA发生了显著上调或

30、发生了显著上调或下调，并证明了下调，并证明了miR-195的上调对心脏的肥大，病理性重的上调对心脏的肥大，病理性重构乃至心衰的发生起到重要作用。这些结果提示我们，构乃至心衰的发生起到重要作用。这些结果提示我们，microRNA不但在心脏的早期心脏发育起到重要作用，而不但在心脏的早期心脏发育起到重要作用，而且在心脏的病理过程起到更为重要的调控作用。且在心脏的病理过程起到更为重要的调控作用。返回返回上一页上一页下一页下一页三三 、miRNAmiRNA检测在神经系统疾病诊断中应用检测在神经系统疾病诊断中应用 miRNAmiRNA被证明与神经系统肿瘤和退行性疾病有关。被证明与神经系统肿瘤和退行性疾病有

31、关。miR-124miR-124和和miR-137miR-137存神经胶质瘤中的水平显著低于正常对存神经胶质瘤中的水平显著低于正常对照组，有抗神经胶质瘤细胞增殖、分化的作用照组，有抗神经胶质瘤细胞增殖、分化的作用.抑制抑制miR-miR-2121的表达可诱导神经胶质瘤细胞凋亡可见的表达可诱导神经胶质瘤细胞凋亡可见miRNAmiRNA在研究神在研究神经胶质瘤发病机制和治疗中的潜力。经胶质瘤发病机制和治疗中的潜力。此外有研究表明帕金森病患者中脑此外有研究表明帕金森病患者中脑miR-133miR-133水平较正常水平较正常对照明显降低。对照明显降低。miR-175miR-175被指出与帕金森病早期临

32、床表现被指出与帕金森病早期临床表现有关。有关。miRNA-25miRNA-25下调阿尔兹海默病患者大脑中的突触蛋白，下调阿尔兹海默病患者大脑中的突触蛋白，与活化氧自由基与活化氧自由基(reactive oxygen species(reactive oxygen species，ROS)ROS)发生协发生协同作用。同作用。返回返回思考题思考题？体内合成过程？体内合成过程？的生物学作用？的生物学作用？4.4.与与siRNAsiRNA的异同点？的异同点？写出几种常用的检测写出几种常用的检测miRNAmiRNA表达的方法？表达的方法？写出几种与相关肿瘤发生有关的写出几种与相关肿瘤发生有关的miRNAmiRNA分子？分子？7.7.miRANmiRAN在生物学研究方面有哪些应用？在生物学研究方面有哪些应用？8.8.应用荧光定量技术应用荧光定量技术 检测检测miRANmiRAN表达的原理？表达的原理？上一页上一页下一页下一页返回返回