《液态活检技术及其临床应用》课件.ppt

1、【Applicable to lecture training work report】液态活检技术及其临床应用Special lecture notes液态活检技术及其临床应用液态活检技术及其临床应用Special lecture notes传统的肿瘤诊断技术传统的肿瘤诊断技术传统肿瘤诊断技术 病理检验诊断影像学检测病理组织检查（HE，IHC）血清标志物检测（CEA,PSA)核磁共振成像（MRI）正电子成像术（PET-CT）X射线断层扫描术（XRAY,CT）超声波检测（B超）内窥镜（Endoscope）分子病理检测（FISH,RT-PCR,NGS）Special lecture notes传

2、统的肿瘤诊断存在的问题传统的肿瘤诊断存在的问题早期筛查早期筛查：标记物不统一,方法不够灵敏或是特异性不足。临床诊断临床诊断:影像学：较灵敏，特异性不足，对病灶大小有要求。病理学：金标准，但是需要组织样本，取样会带来创伤和扩散风险，很多晚期患者无法取样或取样不足。治疗治疗/复发转移监测复发转移监测：影像学：结果普遍存在滞后性。血清标志物：较灵敏，但是特异性不足；有些类型癌症没有合适的血清标志物。Special lecture notes2015年十大突破技术-液态活检技术MIT Technology Review杂志发布了2015年度十大突破技术(10 Breakthrough Technolo

3、gies 2015)的榜单。液态活检技术光荣上榜。液态活检：液态活检：快速、简便、无痛苦、无创伤快速、简便、无痛苦、无创伤的癌症血液检测方法的癌症血液检测方法Special lecture notes传统而又崭新的检测技术传统而又崭新的检测技术-“液态活检液态活检”“液态活检”的定义：A liquid biopsy is a liquid biomarker that can be easily isolated from many body fluids blood,saliva,urine,ascites,pleural effusion,etc.)and,as well as a tis

4、sue biopsy,a representative of the tissue from which it is spread.液体活检是一种液体生物标志物，可以容易地从许多体液中分离血液，唾液，尿液，腹水，胸腔积液等），以及组织活组织检查法，其是从其传播的组织的代表。-Christian Rolfo,Biochimica et Biophysica Acta,2013.Special lecture notes“液态活检液态活检”的标记物的标记物CTCsctDNA(cfDNA)主要指来自于抗凝的外周血全血，完整的肿瘤细胞主要指来自于抗凝血外周血的血浆，片段化的DNA片段一般认为来源于肿瘤

5、原发灶/转移灶肿瘤瘤细胞凋亡/坏死释放的DNA片段活细胞，一般不宜长期保存提取纯化后的核酸，可以保存可以用于细胞学形态、结构分析；也可以分析细胞DNA、RNA、蛋白质等各类标志物一般用于DNA突变监测、甲基化等DNA修饰相关分析用于病情评价、预后判断，肿瘤早期诊断潜力不明确用于个体化治疗，肿瘤早期诊断潜力相对明确还有还有miRNAs，Peptides，Exosomes（外泌（外泌体），体），Secretomes（分泌物质组）等。（分泌物质组）等。Special lecture notes ctDNA（circulating tumor DNA），即循环肿瘤DNA，从字面意思来讲，指的是由肿瘤细

6、胞释放到血液循环系统中的DNA。但是在了解ctDNA之前，我们要知道另一个与之相关的概念cfDNA。cfDNA（cell-free DNA），或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒DNA）。来源：来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞2、来自于凋亡的肿瘤细胞3、来自于肿瘤细胞分泌的外排物什么是ctDNA?Special lecture notes人们逐渐明白，人们逐渐明白，cfDNA中中 携带肿瘤特有突变的那一小部分携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的，确实实是由肿瘤细胞

7、释放出来的，ctDNA的研究终于与肿瘤关联起来。的研究终于与肿瘤关联起来。ctDNActDNA的发现的发现Special lecture notes在几乎所有种类的癌症中，都检测到了ctDNA所带有的标志性突变，并且肿瘤越晚期，病情越严重，肿瘤的恶性程度越高，ctDNA特有突变的频率就越高。一项针对15种癌症进行的ctDNA测序研究显示，分别有47%，55%，69%，82%的I-IV期癌症病人中能检测到高于一定频率的ctDNA突变；而另一项使用更高灵敏度测序技术的研究则表示，对于II期以上的病人，均能100%检测到突变。不同分期癌症的不同分期癌症的ctDNA检出情况检出情况不同癌症种类的不同癌

8、症种类的ctDNA检出情况检出情况Special lecture notesCtDNA临床应用领域临床应用领域 CtDNA作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要的作用，尤其是对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复的作用，尤其是对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。杂的、具有创伤性的活检。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是，遗来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是，遗传突变存在于体内每个细胞。因此，

9、传突变存在于体内每个细胞。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。被定性、定量和追踪。Special lecture notes检测检测9名接受特罗凯一线治疗的名接受特罗凯一线治疗的NSCLC患者血浆中患者血浆中ctDNA的的EGFR突变情况，突变情况，一直到患者进展至一直到患者进展至PD。在接受治疗后，所有患者血浆中的含有EGFR突变的ctDNA浓度出现下降，其中8人的EGFR突变完全消失。有6名患者的血浆中重新检测到EGFR突变的时间要比进展至PD的时间早4个月以上！随着治疗，所有9名患者的血浆中均检出一定量T79

10、0M突变。血浆中没有检测到EGFR的3名患者，进展至PD期时，其肿瘤仅在胸腔内有缓慢进展。利用NSCLC癌患者血浆中的ctDNA检测EGFR突变现有技术用石蜡组织切片样本只能检测60copies以上的突变含量，但是用液态活检通过数字PCR平台却可以检测0-60copies之间的突变含量，更早的发现病情及耐药性，对于癌症患者如果能提前4个月发现病情的变化，生存率会大大提高。-Clin Cancer Res,2014,marchSpecial lecture notes著名的JohnsHopkins大学最近的一项研究揭示了ctDNA的真面目，它其实是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标

11、志物，-Nature Medicine,2014,MaySpecial lecture notes研究者还在不同级别的肺癌患者中对CAPP-Seq进行了验证，发现II-IV期的NSCLC中检测敏感性100%，I期的NSCLC中敏感性为50%，而且在各期的肺癌中的特异性均在96%。在II-IV期和所有分期的肺癌中，根据ROC曲线计算出的AUC分别为0.99和0.95，所以CAPP-Seq具有强大的检测能力。临床资料表明，ctDNA比例低至0.019%的时候也还能够被CAPP-Seq检测到。Special lecture notes研究者用CAPP-Seq测定的ctDNA的水平和肿瘤体积（肿瘤体积

12、用CT和PET评估测定）之间存在显著相关性（p=0.0002，R2=0.89），除了几例I期肺癌患者的肿瘤体积明显高于其ctDNA相对应的大小。随访研究发现ctDNA水平随着疾病进展和相应的治疗，也在不断变化。对10例样本（7例阳性和3例阴性）进行了肿瘤标本（侵入性的活检）和血液标本（非侵入性的CAPP-Seq检测）在筛查和基因型（EGFR和KRAS）检测中的对比，结果发现CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的检测效能差，能够准确测定肺癌的基因型。Special lecture notesctDNA中PI3KCA的检测可用于预测原发性乳腺癌患者的预后1.ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者

13、，其预后要比没有检出的患者差。-Breast Cancer Res Treat，2015，March2.ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。Special lecture notes 循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。CTCCTC形成、播散及转移的模式图形成、播散及转移的模式图原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮间质转化（EMT）间质上皮转化（MET）转移到骨髓和其他

14、器官Special lecture notes CTC的稀有性和异质性Cancers,2013；Nature Review of Clinical Oncology,2010Special lecture notesCTCCTC的临床应用方向的临床应用方向CTC检测6、指导用药3、术后监控1、预后评估2、疗效监测5、早期筛查4、辅助诊断Special lecture notes用两种不同的方法检测用两种不同的方法检测CTCCTC以评估以评估非小细胞肺癌患者的预后非小细胞肺癌患者的预后1.ISET法检出率为 104/210(50%)，CellSearch法检出率为82/210(39%)，两种方法

15、检出CTC的患者的DFS均明显劣于无CTC检出的患者。2.ISET法检出 23/210（11%）的患者外周血中含有间质化的CTC细胞，这种细胞通常意味着更强的侵袭性。ISET法和CellSearch法可以作为CTC检测的互补的方法，两种方法单独或者联合使用都可以用于检测CTC，以评估肺癌手术的预后。-Int.J.Cancer，2011，Vol129Special lecture notes放疗前，65%患者检出CTC，平均检出率9.1CTCs/ml，明显高于放疗后的CTC平均数（0.6个）。有1名在放疗后CTC明显未降低的患者，出现远端转移。-Cancer J，2015，121(1)通过检测非

16、小细胞肺癌患者的外周血中循环肿瘤细胞评价放疗疗效Special lecture notesCTCCTC可作为慢性阻塞性肺炎（可作为慢性阻塞性肺炎（COPDCOPD）患者）患者肺癌早期诊断的新的标志物肺癌早期诊断的新的标志物Hofman P.，PLoS One，2014，Vol9（10）分类COPD患者吸烟者健康人检测结果CTC+CTC-CTC-CTC-人数51634235当时是否检测出癌症NoNoNoNo5年内检测出癌症Yes(5/5)NoNoNoSpecial lecture notesCTC v.s.ctDNA互相排斥还是互为补充？互相排斥还是互为补充？1.可能来源于非肿瘤组织，特异性低；

17、2.血浆中含量较丰富，检测方法简便；3.来自多个细胞的更全面的遗传信息，但一般来自于凋亡的肿瘤细胞；4.ctDNA用于实时监测乳腺癌等疾病的进展和疗效时，灵敏度更高；5.因为不含特异性突变，ctDNA不适用于某些癌症的检测，比如肾癌。V.S.1.细胞形态结合分子标记，特异性高；2.血液中数量稀少，检测难度大；3.只能代表肿瘤细胞的部分亚群，但是是最有侵袭性的一部分细胞；4.反向选择的CTCs检测适用于大多数癌症种类，但有些癌症检出率太低。5.完整的有活性的肿瘤细胞个体，能检测对药物的反应；可以提供新的肿瘤治疗靶点，可以帮助理解肿瘤转移的机制。CTCsCtDNACTCs与与ctDNA检测的有机结

18、合才是检测的有机结合才是未来的方向！未来的方向！Special lecture notesctDNActDNA及及CTCCTC检测与检测与NSCLCNSCLC的靶向治疗疗效的相关性的靶向治疗疗效的相关性1.1.检测检测EGFR突变时，突变时，ctDNA比比CTCs更为灵敏，而且与原位肿瘤的一致性更更为灵敏，而且与原位肿瘤的一致性更高。高。-Clin Cancer Res，2012，April2.CTC数量的减少更适宜用于作为快速评价疗效反应的标记物。数量的减少更适宜用于作为快速评价疗效反应的标记物。Special lecture notes文章主要通过数字PCR比较比较CtDNA、肿瘤标记物、

19、肿瘤标记物及循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞三个方法的比较，其中CtDNA灵敏度为97%，循环肿瘤细胞87%，肿瘤标记物灵敏度为78%，。-NEJM，2013，MarchSpecial lecture notes与肿瘤标志物检测相比，CTC及ctDNA检测更能反映病情的进展。通过ctDNA及CTC检测监测转移性乳腺癌病情进展某些病例里，ctDNA检测与病情更一致；某些病例里，CTC检测与病情进展更一致；Special lecture notes“液态活检”的检测技术越来越丰富，“液态活检”研究将会给临床诊断带来革命性的突破；“液态活检”是现有病理检测技术的必要和有效的补充；“液态活检”的准确性有待更多

20、的临床数据进一步确认；病理科室理应成为“液态活检”的领军科室。总结与展望THANK YOUSWOTSWOT分析模板分析模板SWOT分析是市场营销管理中经常使用的功能强大的分析工具，最早是由美国旧金山大学的管理学教授在80年代初提出来的：S代表strength(优势)，W代表weakness(弱势)，O代表opportunity(机会)，T代表threat(威胁)。市场分析人员经常使用这一工具来扫描、分析整个行业和市场，获取相关的市场资讯，为高层提供决策依据，其中，S、W是内部因素，O、T是外部因素。它在制定公司发展战略和进行竞争对手分析中也经常被使用。SWOT的分析技巧类似于波士顿咨询（BCG

21、）公司的增长/份额矩阵（The Growth/Share Matrix），什么是什么是SWOT分析分析内部环境优势Strengths劣势Weakness机会Opportunities威胁ThreatsSWOT分析传统矩阵示意图分析传统矩阵示意图外部环境SWOT行业分析适用范围行业分析适用范围业务单元及产品线分析竞争对手分析SWOT企业自身SBU SWOT分析SWO TSWO T企业自身SBU SWOT分析主要竞争对手SBU SWOT分析企业的内外部环境与行业平均水平进行比较当选择行业领域中只有少数竞争对手时，可以考虑做SWOT组图进行比较SWOT分析步骤分析步骤分析环境因素分析环境因素构造构造

22、SWOT矩阵矩阵 制定行动计划制定行动计划运用各种调查研究方法，分析出公司所处的各种环境因素，即外部环境因素和内部能力因素。将调查得出的各种因素根据轻重缓急或影响程度等排序方式，构造SWOT矩阵。在完成环境因素分析和SWOT矩阵的构造后，便可以制定出相应的行动计划。SW优势与劣势分析（内部环境分析）优势与劣势分析（内部环境分析）产品线的宽度产品的质量产品价格产品的可靠性产品的适用性服务的及时性服务态度竞争优势可以指消费者眼中一个企业或它的产品有别于其竞争对手的任何优越的东西。需要注意的是一定要从消费者的角度出发，寻找与竞争者或行业平均水平比较，公司的产品与服务有什么优势/劣势；而不是从公司的角

23、度出发，衡量企业的竞争优势。通过一定努力，建立自身竞争优势引起竞争者注意，开始作出反应直接进攻企业优势所在，或采取更为有力的策略竞争优势受到削弱，寻找新的策略增强自身竞争优势根据根据SW分析，公司建立并维持自身的竞争优势分析，公司建立并维持自身的竞争优势企业在维持竞争优势过程中，必须深刻认识自身的资源和能力，采取适当的措施。因为一个企业一旦在某一方面具有了竞争优势，势必会吸引到竞争对手的注意。而影响企业竞争优势的持续时间，主要的是三个关键因素：（1）建立这种优势要多长时间?（2）能够获得的优势有多大？（3）竞争对手作出有力反应需要多长时间？如果企业分析清楚了这三个因素，就会明确自己在建立和维持

24、竞争优势中的地位了。OT机会与威胁分析（外部环境分析）机会与威胁分析（外部环境分析）环境威胁指的是环境中一种不利的发展趋势所形成的挑战，如果不采取果断的战略行为，这种不利趋势将导致公司的竞争地位受到削弱。环境机会就是对公司行为富有吸引力的领域，在这一领域中，该公司将拥有竞争优势。OT机会与威胁分析方法一：机会与威胁分析方法一：PEST法法垄断法律环境保护法税法对外贸易规定劳动法政府稳定性经济周期GNP趋势利率货币供给通货膨胀失业率可支配收入能源供给成本人口统比收入分配社会稳定生活方式的变化教育水平消费政府对研究的投入政府和行业对技术的重视新技术的发明和进展技术传播的速度折旧和报废速度OT机会与

25、威胁分析方法一：波特五力模型机会与威胁分析方法一：波特五力模型进入本行业有哪些壁垒？它们阻碍新进入者的作用有多大？本企业怎样确定自己的地位（自己进入或者阻止对手进入）？购买者转而购买替代品的转移成本；公司可以采取什么措施来降低成本或增加附加值来降低消费者购买替代品的风险？供货商的品牌或价格特色；供货商的战略中本企业的地位；供货商之间的关系；从供货商之间转移的成本本企业的部件或原材料产品占买方成本的比例；各买方之间是否有联合的危险；本企业与买方是否具有战略合作关系行业内竞争者的均衡程度、增长速度、固定成本比例、本行业产品或服务的差异化程度、退出壁垒等，决定了一个行业内的竞争激烈程度构造构造SWO

26、T矩阵矩阵SWT特快专递服务推出较早技术支持较强（如电子追踪服务以邮局为服务终端，服务网络覆盖面广O特快专递”过去的形象不太好认知率不高可靠性与速度不及私营公司私营速递公司多以大公司为主要客户中小机构、个人的需求得不到满足，是个被忽视的市场香港近年经济不太景气，外部环境不利速递业竞争对手林立，正面冲突可能招致报复制订行动计划制订行动计划SWOTWT对策 最小与最小对策，即考虑弱点因素和威胁因素，目的是努力使这些因素都趋于最小。悲观 WO对策 最小与最大对策，即着重考虑弱点因素和机会因素，目的是努力使弱点趋于最小，使机会趋于最大 苦乐参半 ST对策 最小与最大对策，即着重考虑优势因素和威胁因素，目的是努力使优势因素趋于最大，是威胁因素趋于最小。苦乐参半 SO对策 最大与最大对策，即着重考虑优势因素和机会因素，目的在于努力使这两种因素都趋于最大。理想 小大大小