临床检验中发光免疫课件.ppt

1、临床检验中的发光免疫分析临床检验中的发光免疫分析原理、优势和值得注意的问题原理、优势和值得注意的问题北京大学医学部研究员北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会国际生物发光和化学发光学会(ISBC(ISBC）学术理事学术理事Council member of scientific advisory board of Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence&Chemil

2、uminescenceInternational Society on Bioluminescence&Chemiluminescence杨晓林杨晓林 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键由于：单光子计数是在检测随机光子事件由于：单光子计数是在检测随机光子事件因此：随光子数量增多检测效率持续下降因此：随光子数量增多检测效率持续下降所以：准确的校正

3、技术是设备品质的关键所以：准确的校正技术是设备品质的关键模拟（光电流）测量曲线模拟（光电流）测量曲线020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒试剂盒仪器仪器特殊防护特殊防护治理污染治理污染人民币人民币人民币人民币三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用 C肽胰岛素胰岛素胰岛素原胰岛素针对掩蔽性抗原抗体选择抗体选择胰岛素胰岛素多抗或无选择性单抗 X抗体选择抗体选择HCG(TSH、PRL、LH、FSH类似类似)多抗或无选择性单抗针对掩蔽性抗原 结合蛋白PSA PSA 抗体选择抗体选择游离游离PSA针对掩蔽性抗原针对非掩蔽性抗原与结合和游离PSA等分子结合

4、两步法两步法操作时间长操作时间长灵敏度差灵敏度差准确性差准确性差类似物法类似物法操作时间短操作时间短灵敏度较好灵敏度较好准确性较好准确性较好反向竞争法反向竞争法（标记抗体）（标记抗体）操作时间短操作时间短灵敏度更好灵敏度更好准确性更好准确性更好第一代（放免）第一代（放免）第二代第二代第三代第三代血清血清FTFT3 3 、FTFT4 4试剂盒的发展试剂盒的发展（消除结合蛋白对测定的影响消除结合蛋白对测定的影响）测定游离激素的参考方法（测定游离激素的参考方法（“金金”标准）：平衡透析法（透析液过多可导致测值偏高）标准）：平衡透析法（透析液过多可导致测值偏高）操作复杂、采样量大，不适于临床常规操作复

5、杂、采样量大，不适于临床常规FT4 +TBG KT4TBG 游离游离 T4游离结合蛋白游离结合蛋白结合常数结合常数结合结合T4其中：其中：K=由于绝大部分由于绝大部分T4呈结合状态，因此：呈结合状态，因此：T4TBGTT4(总总T4);TBG总总TBGTT4故，故，K所以，样品被稀释所以，样品被稀释N倍后，倍后，T4TBGFT4 TBGTT4FT4(总总TBGTT4)(固定常数，不变固定常数，不变)TT4K(总总TBGTT4)TT4/NK(总总TBG/NTT4/N)FT4=TT4/NK(总总TBGTT4)/N=TT4K(总总TBGTT4)相相 同同即，即，FT4优点：结构简单，运行成本低优点：

6、结构简单，运行成本低缺点：易产生交叉污染，工作效率受限缺点：易产生交叉污染，工作效率受限l对仪器的要求：结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少对仪器的要求：结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少l对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简单化，具体为：对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简单化，具体为：反应反应/洗涤洗涤/测定条件一致；操作步骤少且趋于一致测定条件一致；操作步骤少且趋于一致 反应时间短；反应时间短；通用成分多、专用成分少通用成分多、专用成分少 措施措施l统一标记统一标记/检测系统检测系统l重新优化并统一反应重新优化并统一反应/洗涤洗涤/测定条件和操作步骤测定条件和操作步骤l

7、改变包被模式：改变包被模式：微粒包被：反应效率微粒包被：反应效率，反应时间，反应时间；散射干扰；散射干扰、离子干扰、离子干扰（磁珠）（磁珠）间接包被：反应效率间接包被：反应效率，反应时间，反应时间；散射干扰；散射干扰、检测效率、检测效率 注意内源性物质干扰！（生物素注意内源性物质干扰！（生物素-亲合素系统）亲合素系统）微粒微粒+间接包被：间接包被：工作曲线的特点与校正原理工作曲线的特点与校正原理 工作曲线四要素工作曲线四要素拟合方式：描述曲线基本形状，取决于实验模式和剂量拟合方式：描述曲线基本形状，取决于实验模式和剂量-效应关系走向。效应关系走向。截距：描述曲线位置，修正依据为本底信号和系统误

8、差，修正后导致曲线平移。截距：描述曲线位置，修正依据为本底信号和系统误差，修正后导致曲线平移。斜率：描述曲线俯仰角度，修正依据为结合斜率：描述曲线俯仰角度，修正依据为结合/反应反应/检测效率。修正后导致曲线旋转。检测效率。修正后导致曲线旋转。变形因子：调整曲线形状（取决于抗体活性和特异干扰因素变化）变形因子：调整曲线形状（取决于抗体活性和特异干扰因素变化）基本形状基本形状平移平移旋转旋转变形变形常见拟合方式的性质及其参数的含义常见拟合方式的性质及其参数的含义拟合方式拟合方式拟合方程拟合方程剂量剂量-反应关系反应关系性质性质斜率斜率截截距距变变形形线性线性Y=AY=A*X+BX+BY=AY=A*

9、X+BX+B直线直线A AB B/对数对数LogLog（Y-NY-N）/(Y/(Y0 0-N)-N)=A=A*logX+BlogX+BY=(YY=(Y0 0-N)-N)*10 10B B*X XA A+N+NA=1A=1直线直线A A1 1曲线曲线(Y(Y0 0-N)-N)*10 10B BN NA Alog-log-LogitLogitlnP/(1-P)=AlnP/(1-P)=A*lnX+BlnX+BP=(Y-N)/(YP=(Y-N)/(Y0 0-N)-N)Y=(YY=(Y0 0-N)-N)*e eB B*X XA A/(1+/(1+e eB B*X XA A)+N +N曲线曲线Y Y0 0

10、-N-NN NA AB B四参数四参数Y=(D-C)/1+(X/A)Y=(D-C)/1+(X/A)B B+C+CY=(D-C)/1+(X/A)Y=(D-C)/1+(X/A)B B+C+C曲线曲线D-CD-CC CA AB B三次曲线三次曲线Y=AY=A*X X3 3+B+B*X X2 2+C+C*X+DX+DY=AY=A*XX3 3+(B/A)+(B/A)*X X2 2+(C/A)+(C/A)*X+X+D D曲线曲线A AD DB/AB/AC/AC/AX：待测物浓度；：待测物浓度；Y：信号强度；：信号强度；Y0：零浓度样品信号强度：零浓度样品信号强度;N：非特异结合信号强度（：非特异结合信号强

11、度（NSB）漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证！漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证！定值定值/非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段！（谨防作弊软件）非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段！（谨防作弊软件）待测物待测物包被（结合）抗体包被（结合）抗体放免法放免法免放或免放或发光法发光法标记抗原标记抗原TBG离心沉降离心沉降洗洗涤涤祛祛除除信号信号结果结果信号信号结果结果对于患者来讲，最佳的参考值是自己以往的测定数据，即自身对照；对于患者来讲，最佳的参考值是自己以往的测定数据，即自身对照；因此积累病人的基础数据非常重要。因此积累病人的基础数据非常重要。尤其是性激素、生长激

12、素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。尤其是性激素、生长激素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。灵敏度（真阳性率）：灵敏度（真阳性率）：对真阳性病例的检出率，即对真阳性病例的检出率，即=检出阳性病例数检出阳性病例数/总受检阳性病例数总受检阳性病例数特异度（真阴性率）：特异度（真阴性率）：对真阴性病例报阴性的比率，对真阴性病例报阴性的比率，即即=报阴性结果数报阴性结果数/总受检正常人数总受检正常人数若某肿瘤筛查法的指标达到理论极限，即灵敏度若某肿瘤筛查法的指标达到理论极限，即灵敏度100%，特异度，特异度99%（正常值为（正常值为99%可信限）可信限）而肿瘤的发病率多在十万分之三十以

13、下，因此其应用于正常人群体检时，总阳性病例可能为：而肿瘤的发病率多在十万分之三十以下，因此其应用于正常人群体检时，总阳性病例可能为：30+（100,000-30）（1-99%）=30+999.71030；其中，假阳性率其中，假阳性率=999.7/1030 100%=97%绝大部分为假阳性！绝大部分为假阳性！因此，筛查指标的意义在于高危人群的早期预警，而决不是疾病确诊！因此，筛查指标的意义在于高危人群的早期预警，而决不是疾病确诊！改进办法：采用多个厂家的产品或多指标联合测定（艾滋、肿瘤）改进办法：采用多个厂家的产品或多指标联合测定（艾滋、肿瘤）串联实验：多个检测均阳性才定为阳性，假阳性（误诊）串联实验：多个检测均阳性才定为阳性，假阳性（误诊），假阴性（漏诊），假阴性（漏诊）并联实验：一个指标阳性就定为阳性，假阳性（误诊）并联实验：一个指标阳性就定为阳性，假阳性（误诊），假阴性（漏诊），假阴性（漏诊）取舍原则：分别对误诊和漏诊带来的医学、经济、社会、伦理风险综合分析平衡取舍原则：分别对误诊和漏诊带来的医学、经济、社会、伦理风险综合分析平衡低发病率疾病的筛查指标用于普通人群低发病率疾病的筛查指标用于普通人群产生的巨大产生的巨大“困惑困惑”