第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件.ppt

1、w1.gene silencew2.expression systems of foreign genew3.Isolating and purifying the product of foreign geneswGene Silencing外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。.w Gene silencing can occur at either transcriptional level(TGS,Transcriptional Gene Silencing),or post-transcriptional level(PTGS,Post-Trans

2、criptional Gene Silencing).wTGS:Methylation Induced Repeat-Induced Gene Silencing(RIGC),position effect,and so onwPTGS:cosuppression,and so onHistone:组蛋白组蛋白deacetylase去乙酰化酶去乙酰化酶 基因表达系基因表达系统统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：如大肠杆如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表

3、达系统：如酵母表如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。系统等。w欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：条件：w 通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白；宿主菌的酶系统合成外源蛋白；w 外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序(内含子内含子)，因而必，因而必须用须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；w 必须利用原核细胞的强启动子

4、和必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调序列等调控元件控制外源基因的表达；控元件控制外源基因的表达；w 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架开放阅读框架(open reading frame，ORF)；w 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。w对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。序列、终止子、衰减子等序列。w1.启动

5、子启动子w是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。w大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。）。w-35 Box 和和-10 BoxTTGACATATAATTranscriptionalstartsite53-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45w原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。w w 必须是一种强启

6、动子必须是一种强启动子w能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的的10%-30%以上。以上。w 应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录w便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。w应是可诱导型的应是可诱导型的w用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。w（2）-35区与区与-10区之间的距离区之间的距离w间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。w（3）-35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序w越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Bo

7、x）P tac=3 P trp=11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 启动子tactac（乳糖和色氨酸的杂合启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子)w在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子

8、)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。w2S-D序列 wmRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。wS-DS-D序列序列(AGGAGG)AGGAGG)后面的后面的4 4个碱基：个碱基：w如果是如果是A A（T T）,翻译效率最高；翻译效率最高；w如果是如果是G G（C C）,效率只有效率只有50%50%或或25%25%。wSDSD序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为3 39 9个个碱基。多数情况下为碱基。多数情况下为7bp7bp，此间的碱基多一个或

9、，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。少一个都会影响翻译的起始效率。AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中：AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最为有效；时，最为有效；如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。w3终止子终止子w 在一个基因的3端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。w 共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含GC的区域，GC富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构

10、。w在构建表达载体时，为防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。w起始密码子：起始密码子：GUG 为 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。w主密码子：主密码子：使用的频率高使用的频率高w罕用密码子：罕用密码子：基因组中使用的频率较低。基因组中使用的频率较低。w如果外源目的基因如果外源目的基因mRNAmRNA的主密码子和受体细胞基因组的的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之则低。则低。w构建表达载体时，要对外源基因

11、的碱基进行适当置换，构建表达载体时，要对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主细胞。细胞。w在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中w在细胞内表现为可溶性的蛋白质 包涵体包涵体：在一定条件下，外源基因的表达：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。涵体。包涵体包涵体的组成的组成蛋白质蛋白质非蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物外源基因的表达产物：占大部分，

12、具有正占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般体蛋白一般没有生物学活性没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物受体细胞本身的表达产物：如如RNA聚合聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。的蛋白等。：包括包括DNA、RNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵体形成的本质包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋

13、白质折叠中间体的作用。蛋白质折叠中间体的作用。使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞不损害寄主细胞w 缺点缺点:回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。w分子伴侣共表达（一类能促使其他蛋白质按正确分子伴侣共表达（一类能促使其他蛋白质按正确的方式组装或折叠，本身却不是最终形成的功能的方式组装或折叠，本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成部分的多功能蛋白质）蛋白质的组成部分的多功能蛋白质）w硫氧还蛋白还原酶基因缺陷的寄主菌株硫氧还蛋白还原酶基因缺陷的寄主菌株w降低蛋白质的合成速率降低蛋白质的合成速率w不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为

14、非融合蛋白。w 非融合蛋白(no-fusion protein)(no-fusion protein)的优点在于表达产物的生物学功能更接近于生物体内天然蛋白质。非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶所破坏。w融合蛋白融合蛋白(fusion protein)(fusion protein)是将两个或多个基因是将两个或多个基因的编码区首尾连接的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的由同一调控序列控制构成的基因表达产物。基因表达产物。w含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶破含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。而含另外一些多肽的融合蛋白则坏的最好措施。而含另外一些多肽的融合蛋

15、白则为表达产物的分离纯化等提供了极大的方便。为表达产物的分离纯化等提供了极大的方便。1.1.细胞质中表达细胞质中表达2.2.周质中表达周质中表达w优点：优点：w容易被浓缩和纯化、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。w（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）：能带领蛋白穿）：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。w（3）常用的原核信号肽）常用的原核信号肽w大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽：wphoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内内酰胺酶（酰胺酶（lactamase）、）、肠毒素（肠

16、毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等w金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A A。w枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（endoglucanaseendoglucanase）。）。w胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelBPelB蛋白。蛋白。w（2 2）真核信号肽）真核信号肽w鼠源鼠源RNaseRNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。w也能在细菌中起作用。也能在细菌中起作用。3.胞外表达胞外表达w表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。w用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋）基因构建分

17、泌性融合蛋白；白；w或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。共表达。w由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。蛋白质到培养基中，效果都不太理想。w 这类载体与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体。产物分离产物分离柱（柱（column）GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column）GS

18、TGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用w表达质粒的优化和设计w共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因w提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性w优化发酵过程w没有真核转录后加工的功能，只能表达没有真核转录后加工的功能，只能表达cDNAcDNA而不能表达而不能表达真核的基因组基因；真核的基因组基因；w没有真核翻译后加工的功能，因而产生的蛋白质常没有没有真核翻译后加工的功能，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；足够的生物学活性；w表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体wRNARNA聚合酶不能识别真核生物的启动子聚

19、合酶不能识别真核生物的启动子 w产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解别和降解 构建融合蛋白表达系统构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌芽孢杆菌属属革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌枯草杆菌和和短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌等。等

20、。v利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。1 芽孢杆菌表达载体芽孢杆菌表达载体复制子复制子金色葡萄球菌的复制子金色葡萄球菌

21、的复制子：如：如pUB110、pC194和和pE194等等短小芽孢杆菌的复制子短小芽孢杆菌的复制子：如：如pHY481pHY481和和pWT481pWT481等等含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。之间发生遗传重组。短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造

22、成质粒的丢失。没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。表达载体表达载体自主复制质粒自主复制质粒：是一类：是一类穿梭质粒穿梭质粒，能在，能在大肠杆菌大肠杆菌中复制，中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽芽孢杆菌孢杆菌中进行自主复制。中进行自主复制。整合质粒整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染但它能插入到宿主染色体并

23、将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。噬菌体噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。外源基因表达。1.2 宿主菌宿主菌常用的宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达外源基因在

24、芽孢杆菌中的分泌表达芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略提高表达质粒在细胞中的稳定性提高表达质粒在细胞中的稳定性灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶链霉菌表达系统链霉菌表达系统链霉菌链霉菌是一种是一种革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能，广泛分布

25、于土壤中，能够产生多种生理活性物质。够产生多种生理活性物质。v链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：为非致病性细菌，不产生内毒素；为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。基础。3.1 链霉菌基因表达载体链霉菌基因表达载体启

26、动子启动子结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：与大肠杆菌基因与大肠杆菌基因-10区和区和-35区类似的启动子区类似的启动子仅与大肠杆菌基因仅与大肠杆菌基因-10区类似的启动子区类似的启动子与大肠杆菌基因与大肠杆菌基因-10区和区和-35区序列均不相同的启动子区序列均不相同的启动子终止子终止子具有较长的不完全互补反向重复序列。具有较长的不完全互补反向重复序列。核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。编码蛋白质的碱基序列中编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达的

27、平均含量高达73，密码子的，密码子的第一、第二和第三位碱基的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达含量分别达66、53和和93，而该现象不存在于非编码区。而该现象不存在于非编码区。在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2。密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高的频率明显高于于G的频率。的频率。类似于其它原核生物的类似于其它原核生物的SD序列：序列：5(A/G)GGAGG3。3.2 宿主菌宿主菌变铅青链霉菌变铅青链霉菌天蓝色链霉菌天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最是整个链霉

28、菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。v变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：遗传背景清楚，不含内源性质粒；遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源对外源DNA无明显的修饰作用；无明显的修饰作用；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。白酶合成量低。主要有主要有w（一）真核生物基因表达的特点及优势（一）真核生物基因表达的特点及优势

29、w1 1、转录和翻译分开进行、转录和翻译分开进行 w2 2、有相当大的非编码区（调控序列）、有相当大的非编码区（调控序列）w3 3、有三种不同、有三种不同RNARNA聚合酶参与转录聚合酶参与转录w4 4、初级转录产物能进行剪接加工修饰、初级转录产物能进行剪接加工修饰w5 5、不存在操纵子结构、不存在操纵子结构w6 6、基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分、基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录别转录（二）提高外源基因在植物中表达的策略（二）提高外源基因在植物中表达的策略启动子优化启动子优化转译序列的修饰转译序列的修饰3 3、构建含、构建含 的表达载体的表达载体降低外源基因的拷贝数降低外

30、源基因的拷贝数5 5、利用引导肽进行表达产物的定位、利用引导肽进行表达产物的定位（1 1）、组成型启动子）、组成型启动子w结构基因的表达水平恒定在一定水平，在不结构基因的表达水平恒定在一定水平，在不同组织部位表达水平也没有明显差异。同组织部位表达水平也没有明显差异。w烟草花叶病毒烟草花叶病毒(CaMV)(CaMV)的的35S35S启动子，根癌农启动子，根癌农杆菌杆菌TiTi质粒质粒T-DNAT-DNA的胭脂碱合成酶的胭脂碱合成酶nosnos基因的基因的启动子，和章鱼碱合成酶启动子，和章鱼碱合成酶OCSOCS基因的启动子。基因的启动子。而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻而在单子叶植物转化中最

31、常用的是含有水稻肌动蛋白肌动蛋白Act Act 启动子启动子,玉米泛素玉米泛素UbiUbi启动子启动子w（2 2）、诱导型启动子）、诱导型启动子w在某些特定的物理或化学条件下，诱导基在某些特定的物理或化学条件下，诱导基因转录水平大幅度地提高。菠菜硝酸还原因转录水平大幅度地提高。菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子酶的诱导型启动子,激素诱导序列以及激素诱导序列以及RuBp RuBp 羧化酶小亚基的光诱导启动子羧化酶小亚基的光诱导启动子.w（3 3）、组织特异性启动子：基因的表达只）、组织特异性启动子：基因的表达只发生在某些特定的器官和组织部位。如韧发生在某些特定的器官和组织部位。如韧皮部特异表达的玉米蔗

32、糖合成酶基因皮部特异表达的玉米蔗糖合成酶基因1 1启动子启动子,谷氨酰胺合成酶基因谷氨酰胺合成酶基因3434启动子启动子w提高外源基因的表达水平，选择强组成型启动子。提高外源基因的表达水平，选择强组成型启动子。对于双子叶植物来说，常用的强组成型启动子是对于双子叶植物来说，常用的强组成型启动子是35S35S启动子，如启动子，如35S35S启动子能使启动子能使nptIInptII基因的表达基因的表达水平比水平比nosnos启动子提高启动子提高11O11O倍。也可以利用串联的倍。也可以利用串联的35S35S启动子增强外源基因的表达。采用复合式启启动子增强外源基因的表达。采用复合式启动子是一条十分重要

33、的途径动子是一条十分重要的途径.wNi Ni 等人等人(2019)(2019)将章鱼碱合成酶基因将章鱼碱合成酶基因(Ocs)(Ocs)启动启动子的转录激活区子的转录激活区(-116(-116-333)-333)与甘露碱合与甘露碱合成酶基因启动子成酶基因启动子(Pmas,+68(Pmas,+68-318)-318)构成了构成了复合式启动子复合式启动子,w(1)5-UTR(5(1)5-UTR(5-Untranslated Region)-Untranslated Region)w能影响能影响40 S40 S核糖体亚基的在核糖体亚基的在mRNAmRNA上的移动上的移动及其识别翻译起始位点的效率。及其

34、识别翻译起始位点的效率。w来自烟草花叶病毒来自烟草花叶病毒(TMV)RNA 5(TMV)RNA 5端非翻译端非翻译w序列序列(序列序列)在真核和原核系统中有明在真核和原核系统中有明显增强作用显增强作用 核基质结合区核基质结合区(Matrix attachment(Matrix attachment regions)regions)也称核骨架结合区也称核骨架结合区(Scaffold(Scaffold attachment regions)attachment regions)，是存在于真核细胞是存在于真核细胞染色体中的一段与核基质特异结合的染色体中的一段与核基质特异结合的DNADNA序序列。列。

35、3 3、构建含、构建含 的表达载体的表达载体w大多数大多数M A R s M A R s 位于基因两侧非编码区，位于基因两侧非编码区，富含富含A T A T 和保守的结构域，其最小活性序和保守的结构域，其最小活性序列为列为300 bp300 bp，常与增强子、启动子，常与增强子、启动子(复制起复制起始点等重要元件相邻。构建成始点等重要元件相邻。构建成-,借助边界序列的作用可借助边界序列的作用可使相邻的转录单元保持相对的独立性，并使相邻的转录单元保持相对的独立性，并免受周围染色体结构的影响。免受周围染色体结构的影响。可以在转基因再生植株的当代选择，也可可以在转基因再生植株的当代选择，也可以从多拷

36、贝整合植株的有性繁殖分离后代以从多拷贝整合植株的有性繁殖分离后代中选择。中选择。切实可行的途径是选择适宜的转切实可行的途径是选择适宜的转基因方法，提高单拷贝转基因植株的比例。基因方法，提高单拷贝转基因植株的比例。w外源基因在植物组织细胞中表达时外源基因在植物组织细胞中表达时,其表达其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解,造造成外源蛋白积累量的减少。因此成外源蛋白积累量的减少。因此,采取措施采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要一环。的重要一环。wRubisco Rubisco 小亚基的转运肽序列小亚基的转运肽序

37、列w1 1、导入大片段、导入大片段 w保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整性。因此目的基因上下游的用因子的完整性。因此目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的 位位置效应置效应 而引起缓冲区域的作用，从而提高而引起缓冲区域的作用，从而提高外源基因的表达水平。外源基因的表达水平。w2 2、添加基质附着区、添加基质附着区w3 3、利用具有组织与发育特异性调控作用的、利用具有组织与发育特异性调控作用的启动子和增强子启动子和增强子.启动子是启动子是RNARNA聚合酶进行聚合酶进行精确有效转录必需的。精确有效转录

38、必需的。w4 4、添加内含子、添加内含子 w5 5、利用基困打靶系统实现染色体定位整、利用基困打靶系统实现染色体定位整合合.酵母表达系统酵母表达系统酵母（酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞胞真核生物真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。v酵母菌的特点：酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于2019年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工

39、和修饰系统；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。1 酵母基因表达载体酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和（如抗性基因、复制子等）和宿主染色宿主染色体体DNA上自主复制子结构上自主复制子结构（ARS）、）、

40、中心粒序列中心粒序列（CEN）、）、端粒序列端粒序列（TEL）等一起构建而成。）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒穿梭质粒，能在，能在酵酵母菌母菌和和大肠杆菌大肠杆菌中进行复制。中进行复制。DNA复制起始区复制起始区酵母表达载体包含两类复制起始序列：酵母表达载体包含两类复制起始序列：在在大肠杆菌大肠杆菌中复制的复制起始序列中复制的复制起始序列在在酵母菌酵母菌中引导进行自主复制的序列中引导进行自主复制的序列选择标记选择标记营养缺陷型选择标记：营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。它与宿主的基因型有关。显性选择标记：显性选择标记：可用于各种

41、类型的宿主细胞，并提供直观的可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。选择标记。有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区酵母菌表达载体相当于微型染色体。表达载体上的有丝分酵母菌表达载体相当于微型染色体。表达载体上的有丝分裂稳定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞裂稳定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。表达盒表达盒表达盒由表达盒由启动子启动子、分泌信号序列分泌信号序列和和终止子终止子等组成，是酵母等组成，是酵母表达载体的重要元件。表达载体的重要元件。启动子启动子的长度一般在的长度一般在12kb，其上游

42、含各种调控序列（如上游激活序列、，其上游含各种调控序列（如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和TATA序列（序列（TATA序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激酶酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子）基因启动子等。等。分泌信号序列分泌信号序列是前体蛋白是前体蛋

43、白N端一段长为端一段长为1730个氨基酸残基的分泌信号肽个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：因子前导肽序列、蔗因子前导肽序列、蔗糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等。等。终止子终止子序列相对较短，是决定酵母中序列相对较短，是决定酵母中mRNA3端稳定性的重要结构。与高端稳定性的重要结构。与高等真核生物类似，等真核生物类似，mRNA的的3 端需经过前体端

44、需经过前体mRNA的加工和多聚腺苷化反的加工和多聚腺苷化反应。应。2 酵母基因表达载体的种类酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid，YRP）该载体含有酵母基因组的该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数

45、会迅速减少。整合型质粒载体整合型质粒载体（yeast integration plasmid，YIP）整合型质粒载体不含酵母整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。换整合两种方式。着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体（yeast centromer

46、ic plasmid，YCP）该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有12个个拷贝。拷贝。该载体在酵母细胞中以线性双链该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个的形式存在，每个细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制

47、子和序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。选择标记基因等。酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）3 酵母基因表达系统宿主菌酵母基因表达系统宿主菌主要包括主要包括酿酒酵母酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母乳酸克努维酵母乳酸克努维酵母多型汉森酵母多型汉森酵母酿酒酵母酿酒酵母它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早最早应用于应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多

48、种外源基因产疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其物。其缺点缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可）的表达产物可在细

49、胞中高水平积累。在细胞中高水平积累。AOX1的启动子是一种可诱导的强启的启动子是一种可诱导的强启动子。以动子。以AOX1为启动子，选择为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为基因缺失的突变株作为受体细胞，可高效表达外源基因。目前也可选择组胺醇脱氢受体细胞，可高效表达外源基因。目前也可选择组胺醇脱氢酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时，可对载体上携酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时，可对载体上携带带his标记基因的转化子进行筛选。标记基因的转化子进行筛选。在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、

50、链激酶等几十种。抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。解还比较少，且发酵周期也比较长。乳酸克努维酵母乳酸克努维酵母该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产-半乳半乳糖苷酶。糖苷酶。某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水平和效果高于酿酒