我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析培训课件.ppt
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1、我国人用狂犬病疫苗我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信株病毒糖蛋白生物信息学分析息学分析【摘要】目的 测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白G 基因序列,并对其进行生物信息学分析。方法RT-PCR 扩增3 株病毒糖蛋白G 基因,分别克隆至pGEM-T 载体中,转化大肠杆菌DH5,筛选阳性克隆,进行测序。应用DNAstar MegAlign 软件分析3 株病毒糖蛋白的同源性,AntheProt 5.0 及DNAstar Protean 软件分析3 株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差异。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析2 狂犬病是由狂犬病
2、病毒(Rabies virus,RV)引起的人兽共患疾病,一旦发病,几乎100死亡,疫苗接种是预防该病的重要措施。目前,我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主要有aG、CTN-1V 和PV2061 株,其中aG 株和CTN-1V 株为我国自行分离并传代适应,PV2061 株来源于法国巴斯德株。上述病毒株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示,具有良好的保护效果。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析3 我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白(Glycoprotein,G)全基因序列进行测定,分析3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋
3、白生物信息学分析41.材料与方法 1.1 菌毒株 狂犬病病毒原始种子批4aGV、CTN-1V 和PV2061均由中国食品药品检定研究院病毒一室保存;感受态大肠杆菌DH5。1.2 主要试剂 QIAamp Viral RNA Mini Kit Reverse Transcription System TaKaRa LA Taq誖DRR002A EZNA誖Gel Extraction Kit pGEM-T vector system 我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析5 1.3 引物设计及合成 根据GenBank 中登录的aG、CTN、PV 株病毒M、L 区基因序列,应用Primer Pr
4、emier5.0 软件设计位于M 区及L 区的上下游引物,见表1。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析6我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析71.4 病毒G 区基因的扩增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA,Reverse Transcription System 提供的随机引物逆转录 合成cDNA 第一链,再以其为模板,PCR 扩增目的基因。反应体系为:c DNA 2 l,10 buffer 5 l,2.5 mmol L dNTP 4 l,上下游引物各2 l(10 pmol L),LA Taq 1 l,去离子水补足体积至50 l。反应条件为:
5、95预变性5 min;95 30 s,53 30 s,72 2 min,共30个循环;72再延伸10 min。扩增产物经1琼脂糖 凝胶电泳鉴定,EZNA誖Gel Extraction Kit 纯化回收。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析8 1.5 克隆测序 将PCR 纯化产物与pGEM-T vector 连接,转化 感受态大肠杆菌DH5,蓝白斑筛选阳性克隆,经菌落PCR 鉴定后,送北京三博远志生物技术有限公司测序,每个片段至少送6 个阳性克隆。1.6 病毒糖蛋白生物信息学分析 应用DNAstar 中的MegAlign 软件分析3 株病 毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性;应用 An
6、theProt 5.0 及DNAstar 中的Protean 软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差 异。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析92.结果 2.1 病毒G 区基因扩增产物的鉴定 应用配对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒G 区基因,扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳分 析,均可见约2 300 bp 的特异条带,大小与预期相符;应用3 对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒G 区基因,仅配对引物扩增出相应条带。尽 管应用aG-MGL-F R 引物对PV2061 株病毒G 区 基因进行扩增时有条带出现,但该条带大小及扩增
7、产物浓度均与目的片段明显不符,为非特异性扩增。因此3 对引物均具有特异性,与其他毒株无特异性 配对。见图1。我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析10图1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因扩增产物电泳图我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析112.2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因序列同源性分析 4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白测序结果已提交到GenBank,登录号分别为JN234411、JN234418 和JN234424。测序结果表明,3 株病毒均为基因型狂犬病病毒;其基因组M-G 区间序列长度均为5 bp,CT
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