多色流式细胞术监测急性白血病MRD及其临床意义课件.ppt

1、l浙江大学医学院附属浙江大学医学院附属l儿童医院血液肿瘤科儿童医院血液肿瘤科 汤永民汤永民急性白血病急性白血病初诊初诊时骨髓象时骨髓象ALL AML-M2急性白血病急性白血病完全缓解（完全缓解（CR）时骨髓象时骨髓象ALL CR原始淋巴细胞：原始淋巴细胞：0幼淋巴细胞：幼淋巴细胞：2成熟淋巴细胞：成熟淋巴细胞：6l初诊：初诊：10101012白血病细胞白血病细胞l完全缓解：完全缓解：1010白血病细胞以下白血病细胞以下l微小残留病：微小残留病：1001010l完全治愈：理论上完全治愈：理论上0白血病细胞白血病细胞10121011101010910810710610510410310210110

2、0010-110-210-310-410-510-6初诊或复发初诊或复发可测定可测定MRD的的CR病人病人无法测定无法测定MRD的的CR病人病人彻底治愈的病人彻底治愈的病人MRD检测检测敏感度敏感度方法方法敏感度敏感度覆盖面（）覆盖面（）骨髓形态学骨髓形态学0.10.5x10-1100细胞遗传学细胞遗传学10-210-360融合基因融合基因10-410-625FCM10-410-590（一）正常造血及其分化抗原的表达规律（一）正常造血及其分化抗原的表达规律PLURIPOTENT STEM CELLCD34+CD38-HPP-CFU,LTC-IC,CFU-BLCFU-GEMMCD34+CD38+

3、CD33+CD13+LYMPHOIDSTEM CELLTdT+CD34+BFU-MKCD34+CD61+/-BFU-ECD71+CD36+/-CFU-GMCD34+CD33+CFU-MCFU-G CD19+T PROGENITOR CD7+TOTIPOTENT STEM CELLT4T8CFU-ECD71+CD36+CFU-MKCD61+SELF-RENEWALB CELLB PROGENITORHEMATOPOIESIS（二）正常细胞分化的阶段特异性和特（二）正常细胞分化的阶段特异性和特定的表达顺序及规律定的表达顺序及规律CD34CD90CD38CD45DRKDRLineage antige

4、nsRH123Myeloid lineage differentiationLTC-IC CAFC HPP-CFU CFU-GEMM CFU-GM CD 34 CD 7T cell lineage differentiationCD 7CD 71CyCD 3CD 34CD 1aCD 4CD 8CD 7CD 2CD 3CD 3CD 4CD 2CD 5CD 7CD 3CD 8CD 2CD 5CD 7CD 3CD 4CD 2CD 5CD 7CD 38CD 3CD 8CD 2CD 5CD 7CD 38CD34 Stem cellStage I II IIIThymusBMBloodB cell lin

5、eage differentiationCD 34CD34+/-CD 10CD 19CD 20CD 22CyCD 79aCD 10CD 19CD 20CD 21CD 22CD 24Cm mCD 10CD 20CD 21CD 22CD 24SmIgCD 38CD 20CD 21CD 22 Stem cell Progenitor B Pre-pre-B Pre-B Mature B Plasma cell IgGIgMIgAIgDIgECD 34CD 19CyCD 79aCyCD 22Stem cell CFU-GEMM BFU-E CFU-E Mature RBCCD34CD34CD13CD3

6、3CD34CD71CD36GP-ACD71CD36GP-ACD71GP-AErythrocyte Lineage differentiationStem cell CFU-GEMM BFU-Mk CFU-Mk PlateletsCD34CD34CD13CD33CD34CD41a CD61CD41aCD42CD61CD41aCD42CD61Megakaryocyte lineage differentiation（三）白血病细胞相关性表型（三）白血病细胞相关性表型(1)血细胞分化成熟过程中正常表达的抗原缺失或表血细胞分化成熟过程中正常表达的抗原缺失或表达过度，如达过度，如B细胞系急性淋巴细胞性白

7、血病细胞系急性淋巴细胞性白血病(ALL)CD45的表达缺失或的表达缺失或T-ALL时时CD34、末端脱氧核、末端脱氧核糖核苷酸转移酶糖核苷酸转移酶(TdT)的表达过度等；的表达过度等；(2)淋和髓系相关抗原共表达，如淋和髓系相关抗原共表达，如CD22、CD33的共的共表达等；表达等；(3)不成熟和成熟抗原的非生理性共表达，如不成熟和成熟抗原的非生理性共表达，如CD34、CD56的共表达；的共表达；(4)细胞表面和细胞浆内抗原同时表达，如细胞表面和细胞浆内抗原同时表达，如T-ALL的的细胞膜细胞膜(m)CD7/细胞浆细胞浆(c)CD3、B-ALL的的mCD19/cCD22等，等，(四）四）FCM

8、检测白血病检测白血病MRD技术问题技术问题 敏感度：敏感度：10-410-5，特殊技术状态下，特殊技术状态下可以达到可以达到10-6；细胞收集至少；细胞收集至少10万。万。单参数：采用白血病特异性标志；单参数：采用白血病特异性标志；7.1(11q23,MLL基因基因)，KOR-SA3544(BCR-ABL)；多参数：采用多种白血病相关标志的多参数：采用多种白血病相关标志的联合应用。联合应用。l定量定量组合组合检测频率（）检测频率（）CD19/CD34/CD10/TdT30-50CD19/CD34/CD10/CD2220-30CD19/CD34/CD10/CD3830-50CD19/CD34/C

9、D10/CD4530-50l定性定性CD19/CD34/CD10/CD1310-20CD19/CD34/CD10/CD155-10CD19/CD34/CD10/CD335-10CD19/CD34/CD10/CD655-10CD19/CD34/CD10/CD215-10CD19/CD34/CD10/CD565-10CD19/CD34/CD10/KORSA354410-20CD19/CD34/CD10/Cym m10-20CD19/7.13-5CD19/p533-5l定性定性组合组合检测频率检测频率(%)TdT/CD390-95CD34/CD330-50表型组合检测频率(%)CD13/CD33/C

10、D34/CD11b10-15CD13/CD33/CD34/CD6510-20CD13/CD33/CD34/CD1510-20CD13/CD33/CD34/CD5610-15CD13/CD33/CD34/CD3810-15CD33/CD34/CD117/CD1320-40CD33/CD34/CD117/CD1520-40CD33/CD34/CD117/HLA-DR10-15CD33/CD34/CD117/CD11b10-20CD13/CD33/CD34/CD19 5-10CD13/CD33/CD34/CD2 5-10CD13/CD33/CD34/CD710-20l白血病表型的异质性，个体化现象明

11、显；白血病表型的异质性，个体化现象明显；l必须采取个体化设计表型组合的策略；必须采取个体化设计表型组合的策略；l初诊时全面而完整的免疫表型分析的必初诊时全面而完整的免疫表型分析的必要性。要性。（一）国外的经验（一）国外的经验1、Smith et al.Blood.2000，96(8):2691-2696（小样本小样本）病例及标本：病例及标本：195例儿童例儿童ALL，629份标本；份标本；检测时间点：诱导治疗结束及维持治疗第检测时间点：诱导治疗结束及维持治疗第14、32、56周。周。结结 果：果：1、诱导治疗结束时、诱导治疗结束时MRD 10-4,且持续至维持治疗且持续至维持治疗4周，周，复发

12、率高达复发率高达6816，如果，如果MRD转阴，复发率为转阴，复发率为7%7%；2、如、如MRD持续阳性至持续阳性至32周，高度提示复发的可能，作者周，高度提示复发的可能，作者经治的所有经治的所有4例阳性者均复发，而例阳性者均复发，而8例转阴性者仅例转阴性者仅2例复发例复发(P=0.021)。Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485单位：美国单位：美国COG（Childrens Oncology Group)观察时间：观察时间：2000年年1月月-2005年年3月月病例数：病例数：3303例例（大样本）（大样本）D8：1946例次例次D29：

13、2086例次例次巩固结束：巩固结束：1470例次例次方法：方法：4色色FCM 抗体组合抗体组合:（1）CD20-FITC/CD10-PE/CD45-PerCP/CD19-APC；（2）CD9-FITC/CD34-PE/CD45-PerCP/CD19-PE。ALL MRD与其他预后因子的关系与其他预后因子的关系Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Borowit

14、z MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485MRD10%Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485MRD1%Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Borowitz MJ,et al.Blood,2008,111(12):5477-5485Bassan R,et al.Blood.2009;113:4153-4162 2002年年1月至月至2008年年10月期间，我院共

15、收治急性淋巴细胞月期间，我院共收治急性淋巴细胞白血病（白血病（ALL）患儿）患儿518例，可进行例，可进行MRD评估的评估的260例，例，主要的入选标准：主要的入选标准：（1）根据）根据ALL化疗方案正规治疗化疗方案正规治疗1年以上（年以上（1年内死亡或年内死亡或复发病例纳入分析）复发病例纳入分析）;（2）进行）进行MRD监测至少监测至少2次，其中需在诱导化疗第次，其中需在诱导化疗第15天天或或29天进行过天进行过MRD监测。监测。浙江大学儿童医院血液肿瘤科的经验浙江大学儿童医院血液肿瘤科的经验男性男性 164 164例，女性例，女性9696例；例；11岁岁:2:2例；例；110110岁：岁：

16、220220例；例；1010岁：岁：3838例。例。低危组：低危组：167167例；中危组例；中危组 39 39例；高危组例；高危组 54 54例。例。c-ALLc-ALL：172172例；例；Pre-B ALLPre-B ALL：2121例；例；Pro-B ALLPro-B ALL：8 8例；例；T-ALL T-ALL：3434例；伴髓系表达的例；伴髓系表达的ALL 25ALL 25例。例。分别在患儿诱导化疗开始后第分别在患儿诱导化疗开始后第15天（诱导中天（诱导中期），期），29天（诱导化疗结束），天（诱导化疗结束），3月（早期强化结月（早期强化结束），束），6月（半年强化开始），月（半年

17、强化开始），12月（月（1年强化开年强化开始）进行始）进行MRD检测，根据患儿初诊时免疫标记情检测，根据患儿初诊时免疫标记情况，采用流式细胞术检测不同的四色单克隆抗体况，采用流式细胞术检测不同的四色单克隆抗体组合。组合。lCD45+CD19+CD34+CD10+：60例（占例（占B系系ALL 30.3%）lCD45-CD19+CD34+CD10+：95例（占例（占B系系ALL 46.8%）lCD45+CD19+CD20-CD10+：21例（占例（占B系系ALL 10.4%）lCD45-CD19+CD20-CD10+：11例（占例（占B系系ALL 5.5%）lCD45+CD2+CD3-CD56-

18、：18例（占例（占T系系ALL 52.9%）结结 果果12101010-410d15d293th month12th month6th month5.9%19.6%16.7%17.6%6.9%RemissionClinicalDetectionEstimated leukemia burdenTime After Diagnosis34.3%810FCM监测监测MRD应用举例应用举例1：FCM监测监测MRD应用举例应用举例1：FCM监测监测MRD应用举例应用举例1：FCM监测监测MRD应用举例应用举例1：初诊15天29天180天S1920.0240.0160.015-104090140初诊15

19、天29天180天Chen N，女，女，4岁，岁，commonALL,已已CCR 7个月，继续定期化疗中。个月，继续定期化疗中。Wu DQ，女，女，15岁：岁：VDLD 后后 15天，天，MRD=11646/150000(7.76）应用举例应用举例3：Wu DQ，女，女，15岁：岁：VDLD 后后 29天，天，MRD=1797/150000(1.20）应用举例应用举例5：Wu DQ，女，女，15岁：岁：化疗后（化疗后（VDLD，CAT，HD-MTX 3疗疗程，程，VM26+Ara-C x 3 疗程后，出院。疗程后，出院。2个月后，患儿复发。个月后，患儿复发。例例5随访结果随访结果l存活存活199

20、例例l第二肿瘤第二肿瘤4例例l失访失访14例例l复发复发33例（包括例（包括2例例CNS复发和复发和2例睾丸白血病复发）例睾丸白血病复发）l死亡死亡10例（主要是感染和移植后死亡）例（主要是感染和移植后死亡）l1年年RFS 95.71.3%，3年年RFS 87.32.4%，5年年RFS 82.33.3%5年 RFS：82.33.3%低危组：89.13.7%高危组：62.28.3%中危组：80.37.6%图图4.强化化疗前后强化化疗前后MRD实时水平（实时水平（/105）的变化。）的变化。10-4?:91.64.6%=10-2?:42.316.5%10-3 10-2?:74.67.2%10-4

21、10-3?:78.28.0%10-410-4 10-310-3 10-2MRD n=pEFS(5-year)12350470.92 0.050.78 0.080.75 0.07第15天P 0.00110-2220.42 0.17 10-4?:87.55.0%=10-2?:34.217.4%10-3 10-2?:66.19.6%10-4 10-3?:88.65.4%10-410-4 10-3 10-2MRD n=pEFS(5-year)14838300.88 0.050.89 0.060.66 0.09第29天P 0.00110-3 10-2170.32 0.17 10-4?:92.23.9%=

22、10-3?:62.89.1%10-4 10-3?:86.24.9%3个月P=0.00110-410-4 10-3 10-3MRD n=pRFS(5-year)13260440.92 0.040.86 0.050.63 0.09时间点10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（%）10-2（%）15天91.64.6（n=123）78.28.0（n=50）74.67.2（n=47）42.316.5（n=22）29天87.55.0（n=148）88.65.4（n=38）66.19.6（n=30）34.217.4（n=17）3月92.23.9（n=132）86.24.9*（n=60）62.8

23、9.1*（n=44）6月94.92.7（n=112）80.06.8*（n=55）68.48.5*（n=51）12月95.02.9（n=110）97.22.7（n=42）66.99.9*（n=45）危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（%）10-2（%）低危15292(60.5%)32(21.0%)22(14.4%)6(3.9%)中危3721(56.8%)5(13.5%)8(21.6%)3(8.1%)高危5310(18.9%)13(24.5%)17(32.1%)13(24.5%)l卡方检验：P0.001危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（

24、%）10-2（%）低危146110(75.3%)18(12.3%)14(9.6%)4(2.7%)中危2613(50.0%)6(23.1%)4(15.4%)3(11.5%)高危5115(29.4%)14(27.5%)12(23.5%)10(19.6%)l卡方检验：P0.001可能的危险因素病例数5年RFS比较（%）单因素分析P值多因素分析P值性别（男性）164：9677.14.9 vs.89.93.90.0650.088年龄（1岁或10岁）40：22083.73.6 vs.74.68.10.0310.616WBC（100109/L）33：22763.68.2 vs.86.63.55%）35：22

25、566.710.6 vs.84.33.50.0300.173危险度（中高危）93：16769.56.0 vs.89.13.70.0010.142亚型（T细胞型）34：22679.57.6 vs.83.13.50.0600.14115天MRD水平（10-4）119：12370.95.5 vs.91.64.60.0010.006126例例AML,对对CR时骨髓标本进行了时骨髓标本进行了MRD检测，根据检测，根据MRD水平的不同，将该组病例分成水平的不同，将该组病例分成4种不同危险度：种不同危险度：(1)极低危组极低危组(MRD10-4)8例：无例：无1例复发；例复发；(2)低危组低危组(MRD在在

26、10-410-3)37例：例：3年复发率为年复发率为14%；(3)中度危险组中度危险组(MRD10-2)17例：例：3年复发率为年复发率为84%(P=0.0001)。作者认为：作者认为：MRD的水平严重影响患者无复发生存率和总生的水平严重影响患者无复发生存率和总生存率存率(P=0.003)，是较细胞遗传学改变和获，是较细胞遗传学改变和获CR所需疗程次数所需疗程次数更为重要的预后因子。更为重要的预后因子。2、AML的的MRD监测监测San Miguel et al.Blood.2001,98(6):1746-1751l单位：德国单位：德国BFM协作组协作组l病人病人150儿童，儿童，542份标本

27、份标本l方法：方法：FCMl三年存活率有差别，三年存活率有差别，MRD-VS MRD+的的3-year-EFS:71%+/-6%versus 48%+/-9%,P(Log-Rank)=.029；MRD-AML-BFM Study Group,Langebrake C,et al.Residual disease monitoring in childhood acute myeloid leukemia by multiparameter flow cytometry:the MRD-AML-BFM Study Group.J Clin Oncol.2006 Aug 1;24(22):3686

28、-92.Kern W,et al.Cancer 2008;112:416.（二）浙江大学儿童医院血液肿瘤科经验（二）浙江大学儿童医院血液肿瘤科经验AML：登记采集：登记采集2002.6-2008.9来本院住院治疗的来本院住院治疗的AML病病例例185例，其中例，其中M0 2例，例，M1 7例，例，M2 57例，例，M3 42例，例，M4 22例，例，M5 43例，例，M6 6例，例，M7 6例。其中可用于例。其中可用于MRD评估病例评估病例80例，其中例，其中M0 1例，例，M1 3例，例，M2 28例，例，M3 27例，例，M4 7例，例，M5 12例，例，M6 1例，例，M7 1例。例。病

29、人随访时间：病人随访时间：平均随访时间平均随访时间48.1个月（个月（14.078.5个个月）。月）。AML 13种种CD117+CD34+CD33+CD15+CD117+CD34+CD33+CD7+CD117+CD34-CD33+CD15-CD117+CD34-CD33+CD15+CD117+CD34-CD33+CD7+CD117+CD45+CD33+CD15-CD117+CD45+CD34+CD15+CD117+CD45+CD34+CD33-CD117+CD45+CD34+CD33+CD117+CD45+CD34+CD7+CD117+CD61+CD45+CD33+CD117+CD71+CD

30、45+CD33-CD117-CD45+CD33+CD15+12345678910111213Dai C，男，男，13岁，岁，AML-M5a：异基因骨髓移植前异基因骨髓移植前2个月的个月的MRD水平：水平：450/150000(0.30%)应用举例应用举例4：Dai C，男，男，13岁，岁，AML-M5a：移植前移植前1周的周的MRD水平：水平：626/150000MNC(0.42%)骨髓形态学：幼稚细胞骨髓形态学：幼稚细胞 9 应用举例应用举例4：Dai C，男，男，13岁，岁，AML-M5a：移植后移植后37天，天，MRD704/100000(0.704%)应用举例应用举例4：Dai C，男

31、，男，13岁，岁，AML-M5a：移植后移植后3个月个月MRD水平水平234/100000(0.234%)应用举例应用举例4：80例儿童例儿童AML 5年年RFS图11.80例AML长期生存曲线图。图图11.80例例AML长期生存曲线图。长期生存曲线图。图图12.15天天MRD水平在水平在AML病例中的预后意义。病例中的预后意义。N=21N =43P=0.022l合适标本的选择：合适标本的选择：如适合于外周血的标如适合于外周血的标本不适合于骨髓标本的检测；本不适合于骨髓标本的检测；l抗体组合敏感度的局限性：有些组合只抗体组合敏感度的局限性：有些组合只适合于适合于MRD水平较高水平较高(如如0.1%以上以上)病例病例的检测，当病人的检测，当病人MRD在该阳性率以下时在该阳性率以下时则会受到正常细胞的干扰；则会受到正常细胞的干扰；l抗原变异或丢失问题：特别注意！抗原变异或丢失问题：特别注意！l流式细胞仪监测急性白血病流式细胞仪监测急性白血病MRD具有十具有十分重要的临床意义，它对约分重要的临床意义，它对约90左右的左右的病人能预示早期复发；病人能预示早期复发；l能有效判断化疗后白血病缓解程度的深能有效判断化疗后白血病缓解程度的深浅；浅；l对于合理选择化疗方案及其有效化疗方对于合理选择化疗方案及其有效化疗方案的研究可能具有指导作用。案的研究可能具有指导作用。谢谢 谢！谢！