在基因水平诊断疾病研究生全面课件.pptx
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1、第 19 章在基因水平诊断疾病概述概述 几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系,基因的改变,或是疾病发生的原因,或是疾病发生的结果,或是疾病发生时的伴随现象,而这些现象的出现是有规律的。因此,可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展,疗效和预后。临床诊断l细胞学诊断 生化学诊断 血清免疫学诊断l基因诊断 从基因水平提供更早期、更准确的诊断依据 nucleusGeneDiagnosis transcriptiontranslationFour types of diagnosisClinical manifestationBiologicalDiagnosis SerumDiagnos
2、is ClinicalDiagnosis 目前临床疾病的诊断方法目前临床疾病的诊断方法 基因诊断的特点1、属于“病因诊断”。从分子水平找到特异的致病基因。2、高灵敏度。(微量标本)3、结果稳定4、诊断感染性疾病早期、快速5、应用广、适用性强对疾病的确切诊断预警诊断、产前诊断、新生儿筛查 疾病的易感性、分期分型、疗效监测、预后判断快速诊断体外不易或不能安全培养的病原体法医学鉴定 基因诊断经历三个基本阶段基因诊断经历三个基本阶段 第一阶段:世纪年代,以DNA分子杂交为基础,通过RFLP分析进行。样品量大,过程复杂,同位素 第二阶段:以PCR为基础的一系列技术。操作方便、快捷。第三阶段:应用基因芯片
3、技术。大大提高样品处理的自动化程度和检测结果的准确性。第一节 基因诊断的理论基础 基因诊断的实质是应用分子生物学和分子遗传学理论和技术,分析受检者基因的结构和功能是否正常,从而对受检者作出诊断。一、遗传的物质基础Gene The fundamental unit of life-form for carrying,transmitting and expressing genetic information等位基因病态杂合子病态纯合子 一对染色体的两条染色单体所含基因种类、数目和位置都相同。同一位点的基因及其变异体称为等位基因。二、突 变 Mutation:The heritable alte
4、rations of genetic material caused by internal or external factors,which lead to genotype and/or phenotype change.In general,mutation includes:chromosome aberration gene mutation spontaneous,physical,chemical,biological injury Static mutation a)Point mutation:base substitution,insertion,deletionType
5、s of mutation Dynamic mutation unstable trinucleotide(or“triplet”)repeat sequences 3bp tandem repeats:CAG,CGG or CTGb)Fragment mutation:deletion,insertion,inversion,fusion75years63years44yearsDisorder Location Repeat Normal range Disease range of gene sequence repeat repeatFRAX Xq27.3 CCG*654 pre-mu
6、tation 60200 full mutation 2002000 HD 4p16.3 CAG*934 pre-mutation 36121 DM 19q13.3 CTG*535 pre-mutation 5080 full mutation 802000 *encode region,*5untranslate region,*3UTRFRAX:Fragile X syndromeHD:Huntington diseaseDM:Myotonic dystrophyDisorders caused by dynamic mutation第二节 基因诊断的基本技术基因诊断:利用分子生物学技术,
7、从DNA或RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断。核酸分子杂交和聚合酶链式反应是利用核酸的变性和复性,对核酸进行检测的两大基本技术。前者:标记的已知核酸(探针)检测微量未知核酸分子(目标)的存在;后者:体外对核酸分子进行无限扩增。(对极微量标本进行分析)(一)核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子(DNA或RNA)在特定条件下,与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据:碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交:A=T、GC;DNA与RNA杂交:A=U、GC;变性:在一定温度下,使核酸双链解开为两条单链;复性:随温度逐渐恢复,变性的两条单
8、链重新形成互补双链碱基互补 根据核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理,用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针,与待测样本的单链核酸互补配对,判断互补的同源核酸序列存在与否。核酸探针 指带有标记的某一特定DNA或RNA片断,能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合以检测同源序列。探针标记物 放射性核素 生物素、地高辛、荧光素等制备 样品制备探针杂交检测核酸分子杂交(固相杂交)操作程序核酸分子杂交(固相杂交)操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针探针的种类(1)DNA探针 包括全基因组探针、基因
9、或基因片段探针(2)cDNA探针 用逆转录所得的cDNA克隆后制备,现广泛采用(3)RNA探针 不稳定,不易操作,少用。(4)寡核苷酸探针制备合适探针是核酸分子杂交技术用于基因诊断的关键核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类液相杂交液相杂交:待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。固相杂交固相杂交:待测核酸样本先结合到固相支持物上,再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。待测核酸样本先结合到固相支持物上,再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。常用固相杂交支持物:常用固相杂交支持物:硝酸纤维素膜、尼龙膜等硝酸纤维素膜、尼龙膜等 核酸分子
10、杂交的基本类型:此外,还有上述方法衍生而来的斑点杂交(dot blot)、原位杂交(in situ hybridization)等技术。分类 检测对象 探针 Southern blot DNA片段 DNA或RNA片段 Northern blot RNA片段 DNA或RNA片段 Western blot 蛋白质 标记蛋白质洗膜 Southern 印迹杂交:组织或细胞 含已知基因的重组质粒菌株 基因组DNA 质粒DNA 限制酶酶解及电泳分离 限制酶酶解及电泳分离回收含已知基因的DNA片段 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 标记的探针 预杂交杂交 放射自显影 总DNA目标DNA用限制酶消化不同大小的DNA片
11、断根据片段大小用凝胶电泳分离滤膜转印、变性同标记的DNA探针孵育、鉴定原位杂交 体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片段。片段。原理:类似于原理:类似于DNA的体内复制的体内复制 在试管中的在试管中的DNA的体外合成。的体外合成。用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。Polymerase chain reaction,PCR 1983,PE Cetus company,Kary Mullis二、PCR 技术PCR CycleSTEPSPrimer1Prim
12、er2Geometric AmplificationAfter 30 cycles,theDNA is amplifiedover a billion fold.目的基因增加2nPCR技术在基因诊断中的应用1.采用PCR技术进行基因诊断 体内疾病相关基因缺失或突变 病原微生物基因存在与否正常异常插入 正 异 标2.PCR-限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP)RFLP原理:用某种限制性内切酶消化人DNA 产生许多不同长度的限制酶切片段 当基因突变(点突变、缺失、插入等)酶切位点改变(消失、移动、新位点)限制性片断数量和长度发生改变。PCR-RFLP:PCR扩增包含待测位点的DNA片段
13、用识别该位点的限制性内切酶水解 琼脂糖电泳观察结果。DNA多态性在人群中,个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性。TAGAGTACAG正常突变突变正常Marker3.PCR 等位基因特异性寡核苷酸探针(PCR/ASO)一对探针:针对已知突变,分别合成一对寡核苷酸探针,其中一个为野生型探针(与无突变序列互补),另一个是突变型探针(与突变序列互补),突变碱基及对应的正常碱基置于探针中央。一对引物,严格控制杂交条件53引物1引物2(CT)突变位点 PCR扩增目的片段,与两种特异性ASO探针杂交,据杂交信号判断为正常或异常基因,进一步明确是哪种致病基因。若不止一种突变,还可根据常见的突变体类型,合成一系
14、列具有正常序列和突变序列的ASO。结果判断:正常探针突变探针正常探针突变探针正常探针突变探针正常探针多种突变探针无该种突变突变基因纯合子突变基因杂合子新突变类型4.PCR产物反相点杂交原理和结果判断与PCR/ASO相同。不同:探针固定于膜上,PCR产物在液相中。ASO1ASO2NormalHeteroHomo5.PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)原理:将目的基因PCR 扩增产物变性为单链如某一单链DNA分子存在单个或多个硷基变异构象改变 PAGE时迁移率与正常产物比较发生了变化。缺点:不能检测何种硷基突变及突变的具体部位单链构象多态性:在中性条件下,DNA单链由于分子内碱基相互作用
15、,形成一定的立体构象。长度相同而碱基组成或排列顺序不同的DNA单链,即有不同的构象。PCRATCGWildAmplify region of interestDenature samples in Formamide and HeatATCGMutantDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility differencesTAGC 正常片段 突变片段 PCR扩增 变性成单链 PAGE比较 具体方法:6.PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DG
16、GE)变性剂:尿素、甲酰胺原理:变性剂 DNA发生部分解链 电泳迁移率改变。方法:制备含变性剂(浓度从低到高)的凝胶 PCR产物电泳 当DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时,DNA双链开始分开,迁移速率 不同DNA分子的碱基组成不同,所需变性剂的浓度不同。7.扩增阻滞突变体系NN MN MM NN MN MM 250bp300bp内对照(AB)300bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A C C1 C C1 C C1 B D D1 D D1 D D1(amplification refractory mutation system,ARMS)D1 C C1 A
17、DBDNA250bp8.甲基化特异性PCR(MS-PCR)用亚硫酸氢钠处理模板DNA,可将未甲基化的C U,而CpG岛的甲基化的C则不受影响。原理:设计两对引物:一对甲基化特异性引物:引物中的G可与模板中的C配对 一对非甲基化特异性引物:引物中的A可与模板中的U配对 NNHONH2NHNHOOCUGGACGTAGACCTGCATCT-GCGCTAGGCGGACGTAGA-CGCGATCCG GCGCATGGC AAACATAAA UUTGUATUT-GCGCTAGGC GGACGTAGA-AUGUGATUU TACACATAA 非甲基化引物甲基化引物9.定量PCR即对靶核酸分子进行定量分析。方
18、法:PCR产物直接定量,极限稀释法,靶基因与参照基因的同步扩增,竞争PCR,荧光定量PCR。左侧正常对照第225位碱基为C,而患儿为A 三、DNA序列测定 是诊断基因突变最直接的方法。指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方法有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,即可得出样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物,故称为DNA芯片,又称基因芯片、DNA阵列。四、基因芯片 同时检测多种突变成千上万的寡核苷酸探针有规律排列在芯片上荧光标记的被测 DNA(RNA,cDNA)与芯片上的探针杂交激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描 计算机
19、系统对每个探针上的信号作比较和检测不同的基因诊断策略致病基因检测连锁遗传标志检测基因表达定量分析表型相关的系列基因克隆第三节 基因诊断的策略 不同的疾病,其原因和发生机制不同,基因诊断策略也不同。(一)遗传病基因诊断(一)遗传病基因诊断的策略与方法的策略与方法1.1.直接策略:采用基因突变的诊断方法直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆。2.2.间接策略:即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断。1、直接基因诊断己知的点突变:导致限制性内切酶位点改变:RFLP无限制性酶切位点改变:PCR/ASO 扩增阻滞突变体系 DNA芯片技术未知的点突变:DGGE、SSCP、DNA序列测定
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