分子诊断技术在结核病诊治中的应用课件.ppt

1、分子诊断技术在结核病诊分子诊断技术在结核病诊治中的应用治中的应用武汉大学人民医院检验医学中心武汉大学人民医院检验医学中心李李 艳艳分子诊断技术在结核病诊治中的应用1全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用2全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核感染人数全球结核感染人数2004年后处于下降趋势年后处于下降趋势HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段患者并发结核病数量处于平稳阶段中国结核感染人数全球排名第二中国结核感染人数全球排名第二WHO report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用3全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO

2、 report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用4全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核死亡人数处于下降趋势全球结核死亡人数处于下降趋势斯威士兰结核病感染率最高斯威士兰结核病感染率最高WHO report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用5全球结核病流行状况全球结核病流行状况Globally,an estimated 3.6%of new cases and 20.2%of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in

3、 2012On average,an estimated 9.6%of MDR-TB cases have XDR-TBWHO report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用6全球结核病流行状况全球结核病流行状况 2012年全球新发结核病例为年全球新发结核病例为860万人，万人，中国占总数的中国占总数的12%在在860万新病例中约万新病例中约110万人（万人（13%）为为HIV阳性，这些病例的阳性，这些病例的75%在非洲在非洲 每年约有每年约有130万人死于结核病，我国万人死于结核病，我国为为25万万 结核病每结核病每24秒钟就杀死秒钟就杀死1人人 预计未来预计未来20年还将有年还将有

4、3600万人死于结万人死于结核病。核病。全球每年有全球每年有45万新发万新发MDR-TB，大约，大约4.3万为万为 XDR-TB流流 行行现现 状状感染人数多感染人数多死亡人数多死亡人数多耐药患者多耐药患者多潜伏感染多潜伏感染多“4多多”WHO report，2013分子诊断技术在结核病诊治中的应用7结核病诊治中存在的问题结核病诊治中存在的问题预防预防问题问题诊断诊断问题问题治疗治疗问题问题医疗医疗问题问题检验人员最关检验人员最关心的问题心的问题分子诊断技术在结核病诊治中的应用8根据不同分子水平根据不同分子水平及技术特点来选择及技术特点来选择诊断检测体系诊断检测体系分子诊断技术在结核病诊治中的

5、应用9细菌载细菌载体疫苗体疫苗DNADNA疫苗疫苗灵敏度灵敏度特异性特异性标本类型标本类型 目的用途目的用途费用费用实验平台实验平台 检测时间检测时间方法选择方法选择方法选择的影响因素方法选择的影响因素分子诊断技术在结核病诊治中的应用10孵育孵育4-8周周（阳性）（阳性）（阳性）（阳性）涂阳涂阳=60-98%有结核分枝杆菌，有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定方法进行快速鉴定分子诊断技术在结核病诊治中的应用11IGRAs、TST等等RNA水平水平DNA水平水平蛋白质水平蛋白质水平恒温扩增恒温扩增 变温扩增变温扩增 鉴定鉴定 鉴定鉴定+耐药耐药结核

6、病分子结核病分子诊断诊断 扩增扩增 杂交杂交LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe分子诊断技术在结核病诊治中的应用12分子诊断适宜技术的选择分子诊断适宜技术的选择分子诊断技术在结核病诊治中的应用13T-SPOT.TB与与 QFT-GI为为IGRAs实验实验潜伏性结核潜伏性结核（LTBILTBI）结核菌素试验（结核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube(QFT-GI)蛋白质水平蛋白质水平分子诊断技术在结核病诊治中的应用14全血全血IFN-释放分析技术释放分析技术(IGRA)结核感染者体内存在特异的效应结核感

7、染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T淋巴细淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。）。因此，检测效应因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。的诊断。由于效应由于效应T细胞细胞存活时间很短存活时间很短，而且，而且具有特异性具有特异性，因此可，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于基于IGRA原理的产品目前已被原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德美国、加拿大、英国、德国、意大利

8、、瑞士、法国、荷兰、日本国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中本国的结核诊疗指南中分子诊断技术在结核病诊治中的应用15-干扰素释放实验干扰素释放实验酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术培养滤液蛋白培养滤液蛋白10（CFP 10）早期抗原靶早期抗原靶6（ESAT-6）一、一、T-SPOT技术基础技术基础分子诊断技术在结核病诊治中的应用16由结核杆菌基因组由结核杆菌基因组RD1区区相同的操纵子编码的蛋白相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌绝大多数的环境分枝杆菌也不存在也不存在

9、RD1区区结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原ESAT-6与与CFP 10抗原抗原分子诊断技术在结核病诊治中的应用17PlamaPBMCsGel BarrierErythrocytes检测过程检测过程分离分离PBMCs加入加入PBMCs与结核特异抗原与结核特异抗原37孵育孵育16-20小时小时PBMCs特异抗原特异抗原-干扰素抗体干扰素抗体加入标记二抗，孵育加入标记二抗，孵育1小时小时加入显色液，终止反应加入显色液，终止反应观察结果：观察结果：1个斑点个斑点=1个效应个效应T细胞细胞分子诊断技术在结核病诊治中的应用18结果判断图结果判断图阴性结果阴性结果阳性结果阳性结果空白对照空白对照抗原抗原 A

10、ESAT-6抗原抗原 BCFP10阳性对照阳性对照（PHA）分子诊断技术在结核病诊治中的应用19潜伏性结核（潜伏性结核（LTBI）诊断技术比较）诊断技术比较IGRAs与TST相比，具有更高的灵敏度和特异性IGRAs与BCG,NTM无交叉反应，TST有交叉反应难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测试剂成本非常高分子诊断技术在结核病诊治中的应用20 costs（费用）（费用）availability for clinicians and other health workers（医疗水平）（医疗水平）patient acceptability（患者

11、是否接受）（患者是否接受）ease of distribution and storage（实验平台）（实验平台）分子诊断技术在结核病诊治中的应用21核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术反应条件扩增产物检测方法代表公司RT-PCR热循环DNA实时RocheRT-LAMP恒温DNAEikenGenoType MTBDRplus热循环DNAHain LifescienceCPA恒温DNA优思达NASBA恒温 RNAbioMerieuxTMA恒温RNA终点Gen-ProbeSAT恒温RNA实时仁度SAT：Simultaneous Amplification and Testing(RNA仁度仁度)C

12、PA:Cross Priming Amplification(DNA/RNA,优思达优思达)LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification(DNA,Japan)TMA:Transcription Mediated Amplification(RNA,Gen-Probe)GenoType MTBDRplus：(Hain Lifescience)NASBA:Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(RNA,OT)RCA:Rolling Circle Amplification(DNA,Molecular Stagin

13、g)HDA：Helicase-Dependant Amplification(DNA,Biohelix,NEB)分子诊断技术在结核病诊治中的应用22RNA 拷贝数拷贝数 DNA拷贝数拷贝数 生命力旺盛的病原体生命力旺盛的病原体RNA转录活跃转录活跃较好的愈后指标较好的愈后指标交叉污染少交叉污染少RNA作为临床分子诊断靶标作为临床分子诊断靶标分子诊断技术在结核病诊治中的应用23二、二、SAT技术技术 同一温度下（同一温度下（42），以），以RNA为起始模板为起始模板，通过，通过M-MLV反转录酶产生一反转录酶产生一个双链个双链DNA拷贝拷贝，然后利用，然后利用T7 RNA多聚酶多聚酶从从DNA拷

14、贝上产生多个（拷贝上产生多个（1001000个）个）RNA拷贝；每一个拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的同时，带有荧光标记的探针探针和这些和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况RNA(+)Forward PrimerRTRNase H activityReverse PrimerRTT7100-1000 copiesMolecular BeaconReverse PrimerForw

15、ard PrimerRT/RNase H activityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(-)DNA(+)DNA(+)分子诊断技术在结核病诊治中的应用24TB-SAT操作步骤操作步骤阳性结果阳性结果阴性结果阴性结果恒温扩增-42CRNA 检测-起始靶标与扩增产物都是RNA扩增产物的污染更少-RNA环境中易降解更高的扩增效率-30分钟内扩增10亿倍反应稳定-抑制物少高灵敏度、特异性活菌检测操作简单、快速分子诊断技术在结核病诊治中的应用25分子诊断技术在结核病诊治中的应用26MTBDRsl-鉴定鉴定XDRMTBDRplus-鉴

16、定鉴定MDRMTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群MTBCM-鉴定鉴定MTB和和NTMGene-Probe(TMA/Hain)技术技术分子诊断技术在结核病诊治中的应用27三、三、MTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群(TMA技术技术)方法名称：方法名称：HPV（Hybridization Protection Assay）-杂交保护分析法为杂交保护分析法为Gen-probe公司专利公司专利原理：原理：以以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群检测设备：检测设备：LEADER 50iHPA-MTD(Mycobacterium Tuberc

17、ulosis Direct):2.5h 报告，直接从标本中检测结核菌报告，直接从标本中检测结核菌HPA-Accuprobe:1h 报告，用菌落或自动培养系统的菌报告，用菌落或自动培养系统的菌分子诊断技术在结核病诊治中的应用28样本样本细胞溶解细胞溶解目标目标 r-RNA释放释放MTD技术路线技术路线杂交体杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60C15分钟分钟加入探针加入探针探针探针杂交杂交AEAEAE选择性试剂选择性试剂60C化学发光读数仪化学发光读数仪 荧光检测荧光检测分子诊断技术在结核病诊治中的应用29MTD技术特点技术特点分子诊断技术在结核病诊治中的应用30MTD结核分枝杆菌检

18、测技术特点结核分枝杆菌检测技术特点n采用分子技术快速鉴定（2.5小时小时）结核分枝杆菌复合群n标本可以是涂片阴性或者阳性涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物n唯一获得FDA推荐推荐的凃阴样本快速检测技术n检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）n采用TMA恒温扩增恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证nHPA杂交保护分析技术：灵敏、特异灵敏、特异n严格的实验室防污染技术实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染分子诊断技术在结核病诊治中的应用31MTD结核分枝杆菌的直接检测意义结核分枝杆菌的直接检测意义nTB与其他

19、分枝杆菌区分与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）n提高提高TB检出率检出率 CSF、胸腹水等、胸腹水等n疑似患者疑似患者 长期低热、长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰做血、痰TB菌菌MTD检测检测分子诊断技术在结核病诊治中的应用32DNA作为临床分子诊断作为临床分子诊断靶标靶标分子诊断技术在结核病诊治中的应用33四、四、MTBDRplus-鉴定鉴定MDR方法名称：方法名称：耐多药结核病耐多药结核病(MDR-T

20、B)快速诊断为快速诊断为Hain Lifescience公司公司专利专利原理：原理：采用采用线性探针技术线性探针技术（Line-Probe或称或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复）检测结核分枝杆菌复合群合群利福平利福平(rpoB)和异烟肼和异烟肼(katG和和inhA)等结核治疗药物的等结核治疗药物的耐药基因耐药基因来来判断判断TB体内耐药性体内耐药性MTBDRplus:6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果分子诊断技术在结核病诊治中的应用34抗 结 核药物 靶基因 编码的产物 靶区域和突变率 最常见突变位点 耐药水平 RFPrpoBRNA聚合酶亚单

21、位RRDR 81 bp，95Codon531，30-75高INHkatG过氧化氢酶-过氧化物酶整个基因，60-95S315T，60-95高INHinhA烯酰基还原酶调节区，25inhA-15低INHa h p C-Promoter过氧化物酶启动区，12%低PZApncA吡嗪酰胺酶整个基因，68-97无特定位点高EMBembB阿拉伯糖基转移酶ERDR少数密码子，47-94Codon306，47-89高SMrpsL核糖体蛋白S12Codons 43 和88，40-95K43R，40-90高SMrrs16S rRNA多个碱基，29%513位、905位碱基，各占10.3%低喹 诺 酮类gyrAgyrB

22、DNA旋转酶67106位,75-94%Codon90,94高结核耐药结核耐药的分子的分子机制机制分子诊断技术在结核病诊治中的应用35MTBDRplus技术路线技术路线DNA提取提取PCR扩增扩增探针杂交探针杂交结果判读结果判读分子诊断技术在结核病诊治中的应用36结果解释结果解释 野生型：有杂交带显色为野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变，表示未发生突变 耐药突变位点：有杂交带显耐药突变位点：有杂交带显色为色为“+”，表示发生突变，表示发生突变 敏感：所有野生型探针敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针和所有耐药位点探针“-”耐药：对应药物有耐药：对应药物有1条野生条野生型探针型探

23、针“-”或有或有1条耐药位点条耐药位点“+”分子诊断技术在结核病诊治中的应用37 优势优势快速检测快速检测RFP和和INH的耐药的耐药时间短、操作简单、安全高时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠主观因素影响小、更为可靠不足不足不能检测所有药物的耐药基因型不能检测所有药物的耐药基因型缺少缺少ahpC-oxyR间隔序列范围间隔序列范围不能取代传统细菌学检测、只能不能取代传统细菌学检测、只能作为参考作为参考技术特点技术特点MTBDRplus技术技术分子诊断技术在结核病诊治中的应用38方法方法结果结果比例法药敏结果比例法药敏结果耐药

24、耐药敏感敏感灵敏度（灵敏度（%）特异度（特异度（%）符合率（符合率（%）MTBDRplusRFP耐药耐药48098.0100.098.5敏感敏感116RFP（涂阳）耐药耐药391295.192.192.7敏感敏感2140INH耐药耐药45086.5100.089.7敏感敏感716INH（涂阳）耐药耐药63098.4100.099.5敏感敏感1129MTBDRplus技术性能参数技术性能参数J Clin Microbiol.2010 Aug;45(8):2635-40.Epub 2007 May 30分子诊断技术在结核病诊治中的应用39MTBDRplus技术性能参数技术性能参数中国人群存在一定中

25、国人群存在一定数量的数量的KatG S315N突变突变分子诊断技术在结核病诊治中的应用40nWHO、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时小时内给出药敏鉴定结果n可以做一线结核药物一线结核药物（异烟肼 利福平）、二线结核药物二线结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）n标本可是涂片阳性的痰标本痰标本，或是培养物培养物n技术步骤简单技术步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测n每个试剂条上自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度可信度 HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点分

26、子诊断技术在结核病诊治中的应用41五、交叉引物恒温扩增技术五、交叉引物恒温扩增技术(Cross Priming Amplification,CPA)本试剂盒将病原体本试剂盒将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入应中加入两对两对TB特异性引物、一对特异性探针特异性引物、一对特异性探针，同，同时一次性完成时一次性完成TB DNA的扩增及杂交过程，然后用的扩增及杂交过程，然后用3号一次性号一次性核酸检测装置核酸检测装置对对TB感染进行定性诊断，其感染进行定性诊断，其检测检测灵敏度为灵敏

27、度为10个病原体，高特异引物个病原体，高特异引物设计确保了设计确保了结果的可靠性。由于待测样本的扩增（结果的可靠性。由于待测样本的扩增（PCR管盖和管盖和石蜡油双重保护）和检测过程均在石蜡油双重保护）和检测过程均在物理封闭条件物理封闭条件下下完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物交叉污交叉污染染，防止假阳性的效果，防止假阳性的效果杭州优思达公司杭州优思达公司分子诊断技术在结核病诊治中的应用42CPA技术原理图技术原理图A:引入交叉引入交叉引物位点引物位点B:交叉引交叉引物扩增物扩增C:检测产物检测产物分子诊断技术在结核病诊治中的应用43CPA技术路线图技术

28、路线图核酸提取核酸提取痰液痰液石蜡油石蜡油反应液反应液试剂配制试剂配制63 2恒温扩增恒温扩增金属浴金属浴防污染检测装置防污染检测装置取出反应管取出反应管15-30分钟分钟读取结果读取结果分子诊断技术在结核病诊治中的应用44有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体双重标记的双重标记的特异性扩增物特异性扩增物阳性阳性抗抗体抗抗体有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体停留，显色停留，显色试纸条检测结果判读原理图试纸条检测结果判读原理图抗体包被的颗粒抗体包被的颗粒有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体阴性阴性无特异性扩增物无特异性扩增物抗抗体抗抗体有色颗粒有色颗粒抗抗A抗体抗体无抗抗原无抗抗原有色颗粒流出有色颗粒流出停留，但

29、无色停留，但无色分子诊断技术在结核病诊治中的应用45结果的判读结果的判读n 阳性：阳性：试纸条出现试纸条出现两条红色条带两条红色条带，一条位于质控区（，一条位于质控区（C C线），一条位于线），一条位于检测检测 区（区（T T线）且其强度线）且其强度L4L4（与附带的色卡比较）。表明样本中含有（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限n 阴性阴性：试纸条质控区（试纸条质控区（C C线）出现一线）出现一条红色条带条红色条带，检测区（，检测区（T T线）没有条线）没有条带或者其强度带或者其强度L4L4

30、（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，或其水平低于本试剂盒的最低检出限或其水平低于本试剂盒的最低检出限n 无效无效：试纸条质控区（试纸条质控区（C C线）线）未出现条带未出现条带。表明试剂盒已损坏、失效或。表明试剂盒已损坏、失效或者操作有误者操作有误恒温扩增恒温扩增-CPA分子诊断技术在结核病诊治中的应用46CAP技术技术CPA的优势：快速，简单，灵活，稳定的优势：快速，简单，灵活，稳定ffordable低价低价:不需昂贵的设备和分子实验室不需昂贵的设备和分子实验室Sensitive灵敏：灵敏：10个菌个菌/ml；与快培比较：；与快

31、培比较：87%Specific特异：能鉴别人型和牛型特异：能鉴别人型和牛型结核分枝杆菌结核分枝杆菌User-friendly容易使用：不需容易使用：不需PCR仪仪,操作简单操作简单Rapid/robust快速快速/稳定：样本到结果稳定：样本到结果2小时小时Equipment-free无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴Deliverable易储运：不需冷链运输。装置易储运：不需冷链运输。装置可储存于室温可储存于室温ASSURED 分子诊断技术在结核病诊治中的应用47CPA技术性能参数技术性能参数分子诊断技术在结核病诊治中的应用48六、环介导恒温扩增技术六、环介导

32、恒温扩增技术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种“简便、快速、准简便、快速、准确、廉价确、廉价”的基因扩增方法。它的特征是针对目标的基因扩增方法。它的特征是针对目标DNA链上的链上的六个区段六个区段设计设计四个不同的引物四个不同的引物，然后再利用，然后再利用链置换反应链置换反应在一定温度下进行反应。在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于合成酶、基质等共同置于一定温度下一

33、定温度下（60-65）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15min-1h内实现内实现109-1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断 不需要使双链不需要使双链DNA先变性成单链先变性成单链 扩增反应在扩增反应在等温等温下可持续进行下可持续进行 扩增扩增效率极高效率极高 针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列 仅使用一种链置换

34、仅使用一种链置换DNA聚合酶，聚合酶，成本低廉成本低廉 扩增产物是在同一条扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一链上互补序列周而复始形成大小不一的结构的结构 当模板是当模板是RNA时，仅需加入时，仅需加入逆转录酶逆转录酶即可与即可与DNA一样进行扩增一样进行扩增分子诊断技术在结核病诊治中的应用49LAMP技术原理动画图技术原理动画图分子诊断技术在结核病诊治中的应用50分子诊断技术在结核病诊治中的应用51LAMP方法建立阶段所需的试剂方法建立阶段所需的试剂 DNA 扩增扩增 RNA扩增扩增 n模板模板DNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶ndNTPsn

35、反应缓冲液反应缓冲液n模板模板RNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶n逆转录酶逆转录酶ndNTPsn反应缓冲液反应缓冲液分子诊断技术在结核病诊治中的应用52LAMP技术结果判读原理图技术结果判读原理图LAMP法结果判断方式法结果判断方式-目视检查混浊目视检查混浊 LAMP法结果判断方式法结果判断方式/-目视检查绿色荧光目视检查绿色荧光/浊度检测仪浊度检测仪 分子诊断技术在结核病诊治中的应用53n 扩增反应在等温条件（扩增反应在等温条件（6065）下连续进行）下连续进行 可以使用简便、廉价的扩增装置可以使用简便、廉价的扩增装置n 扩增效率高、可在短时间内完成扩增扩增效率

36、高、可在短时间内完成扩增 可在短时间内得出结果可在短时间内得出结果n 有非常高的特异性有非常高的特异性 可得出可得出“扩增反应发生扩增反应发生=有目的菌存在有目的菌存在”的结论的结论n 产生大量扩增产物，检测方法简便产生大量扩增产物，检测方法简便 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视 方法确认扩增结果方法确认扩增结果n 从扩增到检测可在从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成个反应试管内（封闭系统）完成 可防止由于扩增产物产生的污染可防止由于扩增产物产生的污染n 从从RNA经一步反应可完成扩增经一步反应可完成扩增 无需另外进行逆转录

37、反应无需另外进行逆转录反应LAMP技术特点技术特点分子诊断技术在结核病诊治中的应用54LAMP技术的应用领域技术的应用领域 食品领域食品领域 食物中毒致病菌的检测食物中毒致病菌的检测 食品的卫生管理食品的卫生管理 食物中毒的防止食物中毒的防止 临床领域临床领域 病原菌病原菌、病毒的检测及鉴定病毒的检测及鉴定 通过通过SNP多态性分型决定用多态性分型决定用药量药量 农业领域农业领域 植物病害的早期发现植物病害的早期发现及蔓延防止及蔓延防止 转基因作物的检测转基因作物的检测 环境领域环境领域 环境、水中病原微生物的检环境、水中病原微生物的检测测 工业领域工业领域 工业产品用大量工业产品用大量DNA

38、的生的生产成为可能产成为可能 畜牧业领域畜牧业领域 雌雄性别判断雌雄性别判断 病原微生物的检测病原微生物的检测 遗传病的发现遗传病的发现分子诊断技术在结核病诊治中的应用55LAMP技术性能参数技术性能参数分子诊断技术在结核病诊治中的应用56七、七、DNA微阵列（基因芯片）技术微阵列（基因芯片）技术 DNA微阵列或芯片技术是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相微阵列或芯片技术是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，或将寡核苷酸探针，或将液相合成的探针液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于由微阵

39、列器或机器人点样于尼龙膜或硅片尼龙膜或硅片上，再与上，再与放射放射性同位素或荧光物标记的性同位素或荧光物标记的DNA或或cDNA杂交杂交，用于分析，用于分析DNA突变及多态突变及多态性、性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达测序、监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域博奥生物博奥生物分子诊断技术在结核病诊治中的应用57基因芯片技术操作流程基因芯片技术操作流程样品制备样品制备试剂配制试剂配制杂交杂交激光共焦扫描激光共焦扫描软件判读软件判读分子诊断技术

40、在结核病诊治中的应用58r分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）同时快速检测同时快速检测 17 种分枝杆菌：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、种分枝杆菌：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟龟-脓肿、草、不色、海脓肿、草、不色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。分离株或者痰样本均可检测。分离株或者痰样本均可检测。通通 量：量：同时检测同时检测 17 种分枝杆菌种分枝杆菌速速 度：度：6小时小时 versus 传统传统 4 周周灵敏度：灵敏度：103 CFU/反应反应特异性：防污染体

41、系；对照设计严谨；自动判读特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读r结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）基于基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）福平、异烟肼）通通 量：量：两两种一线抗结核药物种一线抗结核药物、8个突变位点个突变位点速速 度：度：6小时小时versus 传统传统 48 周周灵敏度：灵敏度：103 CFU/反应反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读特异性：防污染体系；对照设计严

42、谨；自动判读基因芯片技术特点基因芯片技术特点分子诊断技术在结核病诊治中的应用59基因芯片技术性能参数基因芯片技术性能参数n 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）n 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）微阵列芯片法）（基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究）（基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究）基因芯片检测和基因芯片检测和DNA测序结果的符合率为测序结果的符合率为100%绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测利福

43、平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别是是93.7、83.8、82.4-中华检验医学杂志中华检验医学杂志2011年第年第9月第月第34卷第卷第9期期 MTC和和NTM的测序符合率的测序符合率分别为分别为100%和和98.4%TB分离株鉴定灵敏度和特分离株鉴定灵敏度和特异性分别为异性分别为99.6%和和100%分子诊断技术在结核病诊治中的应用60各项技术比较各项技术比较检测方法检测方法性能性能检测时间检测时间耗费耗费扩增效率扩增效率靶分子靶分子储运要求储运要求温度温度实验平台要实验平台要求求传统培养传统培养特异性好，灵敏度低鉴定+药敏：2-3月较大-抗原一般普通孵育较高T-SPOT特异性与灵敏度较T

44、ST好24 h高-ESAT-6与CFP 10抗原高二氧化碳孵育较高PCR特异性与灵敏度较好2.5h较高较高DNA高热循环高SAT特异性极好，灵敏度好2 h较低极高RNA一般恒温较低TMA特异性极好，灵敏度好2.5 h较低-RNA一般恒温较低分子诊断技术在结核病诊治中的应用61各项技术比较各项技术比较检测方法检测方法性能性能检测时间检测时间耗费耗费扩增效率扩增效率靶分子靶分子储运要求储运要求温度温度实验平台要实验平台要求求Hain特异性与灵敏度较好鉴定+耐药：6 h高较高DNA高热循环较高CPA特异性与灵敏度极好2 h极低高DNA低恒温低LAMP特异性极好，灵敏度好2 h极低高DNA低恒温低基因芯片基因芯片特异性极好，灵敏度好鉴定+耐药：6 h高高DNA高热循环高Hain特异性与灵敏度较好鉴定+耐药：6 h高较高DNA高热循环较高分子诊断技术在结核病诊治中的应用62Thank You!分子诊断技术在结核病诊治中的应用63