分子生物学技术在病理学中的应用课件.ppt

1、第三章第三章 分子生物学技术分子生物学技术在病理学中的应在病理学中的应用用 1 第一节第一节 原位分子杂交技术原位分子杂交技术 (in situ hybridization，ISH)2核酸分子杂交概述核酸分子杂交概述 检测核酸分子间序列同源性的一种检测核酸分子间序列同源性的一种技术，主要根据核酸碱基互补的原技术，主要根据核酸碱基互补的原则（则（C-G、A-T、A-U）,用已知顺序用已知顺序的核酸片段的核酸片段(DNA或或RNA)作为探针，作为探针，经特殊标记后，与提纯的或组织、经特殊标记后，与提纯的或组织、细胞中的靶核酸进行杂交，对其进细胞中的靶核酸进行杂交，对其进行检测。行检测。核酸分子杂交

2、可以在核酸分子杂交可以在DNA-RNA、RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。之间进行。3杂交类型杂交类型 按其作用方式大致分为固相杂交和按其作用方式大致分为固相杂交和液相杂交两种。液相杂交两种。液相杂交技术是指参加反应的两条液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；包括吸附杂核酸链都游离在溶液；包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等和复性速率液相分子杂交等。4 固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜等），

3、另一条参加反滤膜，其它如尼龙膜等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（）、斑点杂交法（Dot blot）、）、Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blot）、）、Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blot）和组）和组织原位杂交（织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。术和原位杂交免疫细胞化学技术。5原位分子杂

4、交原位分子杂交技术技术（In situ hybridization,ISH)简称原位杂交，简称原位杂交，指应用已知碱基顺指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组化或免疫组化的方法在统，通过组化或免疫组化的方法在被测的核酸原位形成带颜色的杂交被测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电镜下显示出目信号，在显微镜或电镜下显示出目的的DNA或或RNA在细胞内定位。在

5、细胞内定位。6 可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、细胞印片、涂片上进行杂交，因此细胞印片、涂片上进行杂交，因此能结合病理形态的变化，检出细胞能结合病理形态的变化，检出细胞或组织中或组织中200-300拷贝以上的核酸序拷贝以上的核酸序列。列。属于固相核酸分子杂交的范畴属于固相核酸分子杂交的范畴7 区别：菌落杂交系细菌裂解释放出区别：菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交；，然后进行杂交；Southern印印迹杂交法是以鉴定迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定中某一特定的基因片段，而的基因片段，而Northern印迹杂交印迹杂交法是用以检测某一特定的法是用以检测某一

6、特定的RNA片段片段的。它们都只能证明该病原体、细的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。中存在的部位。8基本方法基本方法 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；减低背景染色等；杂交；杂交；杂交后处理；杂交后处理；显示：包括放射性自显影和非放射性标显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色记的显色；对照实验和结果的判断对照实验和结果的判断 9组织固定组

7、织固定 目的：形态结构；保存细胞内的目的：形态结构；保存细胞内的DNA，RNA的水平；探针易于进入的水平；探针易于进入 DNA稳定，稳定，mRNA相对稳定，而相对稳定，而RNA则则易被酶等降解；易被酶等降解；石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。常低于冰冻切片。10常用固定剂常用固定剂 1.4%多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 最常用，不与最常用，不与蛋白质产生广泛交联，不会影响探针穿透蛋白质产生广泛交联，不会影响探针穿透入组织或细胞，较好的保留入组织或细胞，较好的保留

8、RNA；2.3:1乙醇冰醋酸乙醇冰醋酸 增加探针的穿透性，但增加探针的穿透性，但不能最大限度保存不能最大限度保存RNA，对组织有，对组织有损伤；损伤；3.戊二醛戊二醛 较好保存较好保存RNA和组织形态，但和组织形态，但与蛋白质产生广泛交联，影响探针的穿透与蛋白质产生广泛交联，影响探针的穿透性；性；11玻片和组织切片的处理玻片和组织切片的处理 盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗，清水洗净烘干，净烘干，95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h后蒸馏水冲后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在洗、烘干，烘箱温度最好

9、在150或以上或以上过夜以去除任何过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放放。粘附剂涂抹玻片粘附剂涂抹玻片12增强组织的通透性和核酸探针的增强组织的通透性和核酸探针的穿透性穿透性 常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂或称清洗剂Triton X-100或某些消化酶如或某些消化酶如蛋白酶蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强酶等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高组织的通透性

10、和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但会减低杂交信号，但会减低RNA的保存量和影的保存量和影响组织结构的形态，在用量及孵育时间上响组织结构的形态，在用量及孵育时间上应慎为掌握。应慎为掌握。13减低背景染色减低背景染色 杂交后（杂交后（Posthybridization）的酶处理和）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。预杂交（预杂交（Prehybridization）是减低背景）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将组织切片浸入预杂交液中可达

11、到封闭非特组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。异性杂交点的目的，从而减低背景染色。减低残留的内源性的减低残留的内源性的RNA14防止防止RNA酶的污染酶的污染 手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（一日置高温（240，最低温度必须在，最低温度必须在150左右）烘烤以达到消除左右）烘烤以达到消除RNA酶的目酶

12、的目的。的。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。消毒处理。15核酸分子杂交探针核酸分子杂交探针 分子杂交是核酸链间依碱基配对分子杂交是核酸链间依碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性，利用分子杂交特重要理化特性，利用分子杂交特性来对特定核酸序列进行检测，性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链以检测的分子进行标记，这条链称为核酸探针。称为核酸探针。16探针所带电荷、实性材料：硅芯片、玻片和瓷片分子杂交是核酸链间依碱基配对规则的一种结合方式，

13、是核酸的重要理化特性，利用分子杂交特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链称为核酸探针。4、自动化图像分析仪的特点及其应用。Affymetrix公司已经开发了P53突变检测芯片、HIV突变检测芯片和用于BRCAl群体筛查等多种寡核苷酸芯片，并已被广泛应用在此片上将大量已知的探针，按顺序列阵固定于片基上，从而获得一高密度（通常探针的密度在65000600000/cm2）的探针阵列。检测成本低，自动化程度高；将半导体工业中光刻技术与DNA的化学合成方法结合起来，将光不稳定保护基团的四种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，以少量的保护寡合苷酸和试剂按照

14、设计的序列合成DNA。高度特异性的地高辛标记探针进行原位杂交，传统的过氧化物酶显色反应染片过程，在普通光学显微镜下定量检测基因的扩增，操作简单，价格远较FISH低廉，且信号稳定，组织切片储藏方便，并可做组织学评价。比较基因组杂交(CGH)芯片7锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）（三）临床药物研究领域中的应用（药物作用机制、耐药菌株和药敏检测、新药开发等）液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。但是日本佳能公司 能把喷印点直径大小由150-100m降到30-25m。与传统检测

15、方法相比，在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，能及早诊断，待测样品用量小；FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.第一节 原位分子杂交技术 (in situ hybridization，ISH)常用的对照试验有下列几种。目前已有如地中海贫血、先天性胰岛素分泌过多症等的诊断芯片。核酸探针的类型核酸探针的类型 根据标记方法可分为放射性和非放根据标记方法可分为放射性和非放射性两类。射性两类。放射性者有污染，显影时间长等；放射性者有污染，显影时间长等；非同位素标记，常用的有生物素、非同位素标记，常用的有生物素、地高辛、

16、地高辛、5-BrdU(嗅脱氧尿嘧啶核苷嗅脱氧尿嘧啶核苷)、荧光素等。荧光素等。非同位素标记操作方便，标记好的非同位素标记操作方便，标记好的探针可以长期保存，随时取用，且探针可以长期保存，随时取用，且实验时间短，结果可在光镜下观察。实验时间短，结果可在光镜下观察。1718 根据探针的核酸性质不同可分为根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针（单链探针（单链DNA和双链和双链DNA ）、RNA探针、探针、cDNA探针、探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。探针和寡核苷酸探针等。cDNA（complementary DNA）探）探针：以针：以RNA为模板，经逆转录酶催为模板，经逆转录酶催化按照化按照RN

17、A的核苷酸顺序合成的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息的方向相这一途径与一般遗传信息的方向相反，故称逆转录。反，故称逆转录。cDNA是指互补是指互补于于mRNA的的DNA分子。分子。1920 21寡核苷酸探针寡核苷酸探针 近年应用较多的寡核苷酸探针，常为近年应用较多的寡核苷酸探针，常为20-30个碱基，分子量小，有利于探针进入个碱基，分子量小，有利于探针进入细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。非克隆性非克隆性DNA探针，探针，在无在无cDNA的情况下，的情况下，可根据已知文献发表的共同序列可根据已知文献发表的共同序列由由DNA合成仪依照所需杂交

18、的靶核苷酸序列合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工人工合成合成。22寡核苷酸探针寡核苷酸探针 制造方便，价格低廉，也可进行放制造方便，价格低廉，也可进行放射性与非放射性标记射性与非放射性标记 特异性不如克隆性探针强，亦不如特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高其杂交信号高23成套成套ISH试剂盒试剂盒 病毒系列病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV等等)癌基因系列（癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、nm23、P16、P21等）等）细胞因子系列细胞因子系列(EGF、bEGF)24原位分子杂交实验步骤：原位分子杂交实验步骤：（1）切片脱蜡入水（冰冻切片先用）切片脱蜡入水（冰冻切片先用

19、多聚甲醛固定）；（多聚甲醛固定）；（2）PBS（0.1M）洗涤，洗涤，5分钟分钟1次（次（RNA杂交用杂交用DEPC水洗涤）；（水洗涤）；（3）0.1N HCL，10分钟；（分钟；（4）PBS洗涤洗涤3分钟分钟2次；次；（5）蛋白酶）蛋白酶K消化：（消化：（6）-（7）-25杂交后处理杂交后处理 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。漂洗。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的

20、中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对配对RNA除去。除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。低而温度由低到高。切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。增强了背景染色。26(4)TAGCTCAT二、合成点样 ：DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。基因表达mRNA的水平反映了在不同的环境、细胞类型、细胞生长阶段和细胞状态下的功能信息，分析

21、差异表达的基因对于研究基因的功能十分重要。比较基因组杂交(CGH)芯片5uMg2+1.二、合成点样 ：DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。1993年Mullis获得了诺贝尔化学奖.膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜优点是定量准确重现性好，缺点是喷印的斑点大，密度低。杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；半导体芯片很怕水，接触到水溶液就会短路，而生物芯片恰恰要分析液体，输入其中的可能是血液、尿液、唾液等体液，不会出现短路现象；反应体系：DNA模板，一种引物，四种三磷酸核苷，TaqDNA聚合

22、酶及含 MgCL2的缓冲液。特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。（二）肿瘤研究中的应用常用的对照试验有下列几种。液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。（B）检测肿瘤标志物mRNA,对肿瘤的早期诊断及治疗有重要的意义。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。显示显示 又称检测系统。又称检测系统。根据核酸探针标记物的种类分别进根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。行不同显色处理。27对照实验

23、和结果的判断对照实验和结果的判断 常用的对照试验有下列几种。常用的对照试验有下列几种。（1 1）将）将cDNAcDNA或或cRNAcRNA探针进行预杂交探针进行预杂交(吸吸收试验收试验)。（2 2）与非特异性）与非特异性(载体载体)序列和不相关探针序列和不相关探针杂交杂交(置换试验置换试验)。（3 3）将切片应用）将切片应用RNARNA酶或酶或DNADNA酶进行须酶进行须处理后杂交。应用同义处理后杂交。应用同义RNARNA探针进行杂交。探针进行杂交。（4 4）以不加核酸探针杂交液进行杂交）以不加核酸探针杂交液进行杂交(空空白试验白试验)。（5 5）组织对照用已知确定为阳性或阴性组）组织对照用已

24、知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。织进行杂交对照。（6 6）应用未标记探针做杂交进行对照。）应用未标记探针做杂交进行对照。28 荧光原位杂交荧光原位杂交 荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是在是在20世纪世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术细胞遗传技术,以荧光标记取代同位以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交素标记而形成的一种新的原位杂交方法方法,探针首先与某种介导分子探针首先与某种介导分子(reporter

25、 molecule)结合结合,杂交后再杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料染料.29 FISH的基本原理是将的基本原理是将DNA(或或RNA)探针用探针用特殊的核苷酸分子标记特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂然后将探针直接杂交到交到DNA切片上切片上,再用与荧光素分子偶联的再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列，可对序列，可对DNA定性、定位、相对定定性、定位、相对定量分析量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点长期

26、保存、能同时显示多种颜色等优点,不不但能显示中期分裂相但能显示中期分裂相,还能显示于间期核还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术。色荧光原位杂交技术。缺点：方法费时、价格昂贵，所需设备复缺点：方法费时、价格昂贵，所需设备复杂并需特殊的照相机记录暂时的信号及不杂并需特殊的照相机记录暂时的信号及不能观察组织形态学等。能观察组织形态学等。30CISH 显色原位杂交法（显色原位杂交法（Chromogenic in situ hybridization，CISH）2000年年Tanner首次报道了采用首次报道了采用CISH法检测法检测

27、HER2基因扩增的可行性基因扩增的可行性,研究显研究显示示CISH与与FISH具有极强的一致性。具有极强的一致性。高度特异性的地高辛标记探针进行原高度特异性的地高辛标记探针进行原位杂交，传统的过氧化物酶显色反应位杂交，传统的过氧化物酶显色反应染片过程，在普通光学显微镜下定量染片过程，在普通光学显微镜下定量检测基因的扩增，操作简单，价格远检测基因的扩增，操作简单，价格远较较FISH低廉，且信号稳定，组织切片低廉，且信号稳定，组织切片储藏方便，并可做组织学评价。储藏方便，并可做组织学评价。31原位杂交的应用简介原位杂交的应用简介:特异性高；可以精确定位；能在成特异性高；可以精确定位；能在成分复杂的

28、组织中进行单一细胞的研分复杂的组织中进行单一细胞的研究；不需要从组织中提取核酸，对究；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；可完整地保持组织与细的敏感性；可完整地保持组织与细胞的形态。胞的形态。由定性进入定量，应用也更加广泛由定性进入定量，应用也更加广泛。32应用应用 基础研究：如基因组团基础研究：如基因组团(Gene mapping)，转基因检测，基因表达，转基因检测，基因表达定位，核定位，核DNA和和mRNA的排列和运的排列和运输、复制和细胞的分类等；输、复制和细胞的分类等；临床研究：如细胞遗传学，产前诊临床研究：如细胞遗传学，产前

29、诊断，肿瘤和传染性疾病的诊断，生断，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定和病毒学的病原学诊物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。断等。33(1)在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用:（A）.检测肿瘤组织中癌基因，抗癌基因检测肿瘤组织中癌基因，抗癌基因的表达的表达,以判断预后。如发现原癌基因以判断预后。如发现原癌基因C-myc在在Burkitt 淋巴瘤淋巴瘤,大肠癌，小细胞肺大肠癌，小细胞肺癌中有扩增；癌中有扩增；CerbB-2的扩增与乳癌淋巴的扩增与乳癌淋巴结转移呈正相关。结转移呈正相关。34（B）检测肿瘤标志物）检测肿瘤标志物mRNA,对肿瘤的早对肿瘤的早期诊断及治疗有重要的意义。如检测人肝

30、期诊断及治疗有重要的意义。如检测人肝脏和癌旁肝细胞中脏和癌旁肝细胞中AFPmRNA，在肝癌细，在肝癌细胞及癌旁组织均发现了胞及癌旁组织均发现了AFPmRNA,但癌但癌组织中组织中AFPmRNA阳性较均一阳性较均一,而癌旁肝而癌旁肝中中AFPmRNA阳性呈散在分布阳性呈散在分布.3536液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；这些DNA分子的粘贴位置和其中的基因状态等信息都被存贮在计算机里。保持ELISA方法学的成熟、方便、自动化程度高的基础上，又具有芯片技术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点。6不对称PCR:在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50100:1）进行扩增，可得到

31、单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。三、检测分析方法高通量、微型化和自动化（4）PBS洗涤3分钟2次；dNTP:dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，组织和群体生物学：遗传聚类研究；可分为长产物片段和短产物片段两部分。研究者可按参数设计高密度互补的DNA阵列。石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。应用同义RNA探针进行杂交。通过切片辅助系统将其转移并固定到硅化和胶化玻片上即成为组织芯片。5uMg2+1.在此片上将大量已知的探针，按顺序列阵固定于片基上，从而获得一高密

32、度（通常探针的密度在65000600000/cm2）的探针阵列。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。第三，从材料上来说，半导体芯片以硅为基本材料，而制备生物芯片使用的材料则比较广泛，除了硅，还可以使用玻璃、塑料等其他材料。(2)组织、细胞中病毒组织、细胞中病毒DNA或或RNA的检测的检测 在淋巴瘤细胞及鼻咽癌细胞中发现在淋巴瘤细胞及鼻咽癌细胞中发现E B V，在 肝 炎、肝 癌 细 胞 找 到，在 肝 炎、

33、肝 癌 细 胞 找 到HBVDNA，尤其是在原发性肝癌中，尤其是在原发性肝癌中其整合率可达其整合率可达90%;粥样硬化的主动脉内发现了单纯疱粥样硬化的主动脉内发现了单纯疱疹病毒；疹病毒；检测细菌，疟原虫等的核酸序列。检测细菌，疟原虫等的核酸序列。37383940(3)细胞的生物合成细胞的生物合成及遗传疾病研究中的应用及遗传疾病研究中的应用 组织，细胞内组织，细胞内mRNA可以反映组织合成某可以反映组织合成某种蛋白质或多肽的能力，其敏感性要比直种蛋白质或多肽的能力，其敏感性要比直接测定蛋白质高接测定蛋白质高1000倍，以倍，以cDNA作为探作为探针的针的ISH结合免疫组化技术，可以了解单结合免疫

34、组化技术，可以了解单个细胞内个细胞内mRNA的翻译水平，即蛋白质合的翻译水平，即蛋白质合成能力，从而了解组织器官的代谢和功能成能力，从而了解组织器官的代谢和功能状态，以及器官组织内不同细胞的功能差状态，以及器官组织内不同细胞的功能差异，并能同时进行形态学观察。异，并能同时进行形态学观察。4142 第二节第二节 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)43聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。特异、敏感、产率高、特异、敏感、产率

35、高、快速、快速、简便、重简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用星期才能做到的事情，用PCR几小时便可几小时便可完成。完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性技术是生物医学领域中的

36、一项革命性创举和里程碑。创举和里程碑。44 Korana于于1971年最早提出核酸体外扩增的年最早提出核酸体外扩增的设想设想 1985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室公司人类遗传研究室的的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。酶链反应。1993年年Mullis获得了诺贝尔化获得了诺贝尔化学奖学奖.Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的的Klenow片段片段;1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR;1988年年Saiki 等从温泉中分离

37、的一株水生嗜等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种中提取到一种耐热耐热DNA聚合酶。聚合酶。PCR技术简史技术简史 45PCR原理原理 PCR实际上是以实际上是以DNA为模板，在引物和为模板，在引物和4种核苷酸存在的条件下，在种核苷酸存在的条件下，在DNA聚合酶聚合酶作用下出现的酶促合成反应。作用下出现的酶促合成反应。PCR最重要的组分是引物，是根据模板最重要的组分是引物，是根据模板DNA的序列设计合成的两条的序列设计合成的两条20个核苷酸个核苷酸左右的寡核苷酸链，这两个引物分别特异左右的寡核苷酸链，这两个引物分别特异性结合在模板性结合在模板D

38、NA二条链的两侧（二条链的两侧（3端）。端）。46优点是定量准确重现性好，缺点是喷印的斑点大，密度低。(2)组织、细胞中病毒DNA或RNA的检测核酸分子杂交可以在DNA-RNA、RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。（三）临床药物研究领域中的应用（药物作用机制、耐药菌株和药敏检测、新药开发等）反应体系：DNA模板，一种引物，四种三磷酸核苷，TaqDNA聚合酶及含 MgCL2的缓冲液。（1）检测外源性基因片段，病毒性，寄生虫性及细菌性疾病的诊断，提高检出率，集中在病毒感染的检查上；液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；将半导体工业中光刻技术与DNA的化学合成方法结合起来，将光不稳定

39、保护基团的四种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，以少量的保护寡合苷酸和试剂按照设计的序列合成DNA。保持ELISA方法学的成熟、方便、自动化程度高的基础上，又具有芯片技术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点。肿瘤分子病理分型：肿瘤表达的分子图谱以进行疾病分子分型，为临床实施个体化治疗奠定基础Affymetrix公司已经开发了P53突变检测芯片、HIV突变检测芯片和用于BRCAl群体筛查等多种寡核苷酸芯片，并已被广泛应用PCR在病理学中的应用病理学中应用的PCR种类：杂交信号的强弱与样品中靶基因芯片是大约半英寸(1.（三）临床药物研究领域中的应用（药物作用机制、耐药菌株和药敏检测、新药开发

40、等）1993年Mullis获得了诺贝尔化学奖.（二）肿瘤研究中的应用(2)组织、细胞中病毒DNA或RNA的检测在此片上将大量已知的探针，按顺序列阵固定于片基上，从而获得一高密度（通常探针的密度在65000600000/cm2）的探针阵列。反应体系：反应体系：DNA模板，一种引物，四种模板，一种引物，四种三磷酸核苷，三磷酸核苷，TaqDNA聚合酶及含聚合酶及含 MgCL2的缓冲液。的缓冲液。47循环循环（1）变性）变性(denaturation)：在：在95 左右，左右，常规采用常规采用94，30秒秒-1分钟，在高温条件分钟，在高温条件下使模板下使模板DNA解链为单链模板；解链为单链模板；（2）

41、退火）退火(annealing)：在较低温度下，：在较低温度下，引物特异地结合到引物特异地结合到DNA模板上，温度在模板上，温度在55 左右，时间左右，时间30秒秒-1分钟；分钟；（3）延伸）延伸(extension)：在：在72 条件下，条件下，DNA聚合酶根据模板的序列，在引物的聚合酶根据模板的序列，在引物的3端新合成的互补链不断延伸。根据模板的端新合成的互补链不断延伸。根据模板的长度，延伸时间一般长度，延伸时间一般1-2分钟。分钟。48495051PCR的反应动力学的反应动力学 PCR反复进行，使反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。扩增量呈指数上升。反应最终的反应最终的DNA 扩增量可用

42、扩增量可用Y(1X)n计算。计算。Y代表代表DNA片段扩增后的拷贝数，片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，表示平均每次的扩增效率，n代表循环代表循环次数。次数。平均扩增效率的理论值为平均扩增效率的理论值为100%，反应初，反应初期，靶序列期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，片段的增加呈指数形式，随着随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现或静止期，即出现“停滞效应停滞效应”，这种效应，这种效应称平台期。称平台期。52PCR扩增产物扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两可

43、分为长产物片段和短产物片段两部分。部分。短产物片段的长度严格地限定在两短产物片段的长度严格地限定在两个引物链个引物链5端之间，是需要扩增的端之间，是需要扩增的特定片段特定片段 短产物片段和长产物片段是由于引短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的物所结合的模板不一样而形成的 53分析与鉴定分析与鉴定 PCR产物的分析，可依据研究对象产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。和目的不同而采用不同的分析方法。常用方法如凝胶电泳分析、琼脂糖常用方法如凝胶电泳分析、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶切分析、分子杂交（酶切分析、分子杂交

44、（Southern印印迹杂交、斑点杂交）、核酸序列分迹杂交、斑点杂交）、核酸序列分析等。析等。54PCR反应体系与反应条件（一）、标准的（一）、标准的PCR反应体系：反应体系：10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10-100pmol模板模板DNA 0.1-2ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul55PCR反应五要素：反应五要素：引物引物:PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物产物的特异性取决于引物与模板的特异性取决于引物与模板DNA互补的互补的程度

45、。程度。酶及浓度酶及浓度:浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。浓度过低则合成产物量减少。dNTP:dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效扩增效率有密切关系，率有密切关系，模板模板:模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一成败与否的关键环节之一.Mg2+:Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量扩增的特异性和产量有显著的影响有显著的影响 56打印时针头与芯片接触。（5）组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、nm23、P16、P21等）5uMg2+1.主要

46、特点：高通量、微型化和自动化。可检测宫颈癌，肝癌，鼻咽癌等与病毒密切相关的肿瘤中病毒在细胞基因中整合状态和其位点，研究病毒和肿瘤的关系，为肿瘤的防止提供理论依据；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；扩增同一模板的几个区域。（1）、基因差异表达分析、优点是定量准确重现性好，缺点是喷印的斑点大，密度低。组织芯片技术可以与DNA、RNA、蛋白质、抗体等技术相结合，与传统的病理学技术、组织化学及免疫组化技术相结合，在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能三个水平上进行研究。戊二醛 较好保存RNA和组织形态，但与蛋白质产生广泛交联，影响探针的穿透性；但是，由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译

47、后加工等多种调节机制，基因的表达，或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；由4个核苷组成的任一套探针，因此，n个核苷酸长的芯片需要4n循环来合成。首先，将支持物表面羟基化或氨基化（视所要固定的分子为寡核苷酸或核酸而定），在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基，可用光照去除，用特制的光刻蔽光膜（mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位。每个探针都由A、T、C、G的不同组合，换上不同的光刻蔽光膜，光线透射到片上的不同区时，加上不同的核苷酸，如加A核苷时用A膜、加C核苷时换C膜，如此重复这一过程；肿瘸基因表达谱研究：

48、肿瘤发生是在外界因素的作用下，基因水平发生改变后出现的一系列症状，所以通过基因芯片就能研究其表达谱；Mg2+:Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响常用的对照试验有下列几种。PCR常见类型 1逆转录逆转录PCR(RT-PCR)：RNA经逆转经逆转录后可作为录后可作为PCR的模板的模板.,用来扩增用来扩增RNA。2竞争逆转录竞争逆转录PCR(C-RT-PCR)：低丰：低丰度度RNA定量的好方法。定量的好方法。3多重多重PCR（multiples PCR）：在同）：在同一一PCR体系中加入多对引物可用于基本体系中加入多对引物可用于基本长度很长，发生多处缺失的检测。扩增同长度很长，发生多处缺

49、失的检测。扩增同一模板的几个区域。一模板的几个区域。4多种多种PCR：可同时加入多套以生物素：可同时加入多套以生物素标记的引物标记的引物PCR反应。反应。57 5反向反向PCR（iverse polymerase chain reaction）：对一个已知的）：对一个已知的DNA片段两片段两侧的未知序列进行扩增和研究。侧的未知序列进行扩增和研究。6不对称不对称PCR:在在PCR反应体系中，限制反应体系中，限制引物之一的浓度（引物之一的浓度（50100:1）进行扩增，）进行扩增，可得到单链可得到单链PCR产物产物,可用于制备单链测可用于制备单链测序模板或单链序模板或单链DNA杂交探针。杂交探针。

50、7锚定锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）8着色互补试验或荧光着色互补试验或荧光PCR 9双温双温PCR（two-temperature PCR）58PCR技术的应用技术的应用 研究：基因克隆；研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合合DNA序列；转序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的或表达载体；检测某基因的内切酶多态性内切酶多态性 诊断：细菌诊断