腹腔镜全子宫切除护理查房讲课课件.ppt

1、腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤 人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？的生命活动？人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色。色。人体中大约有人体中大约有1010万种蛋白质。万种蛋白质。测定蛋白质结构的意义测定蛋白质结构的意义vX-X-射线晶体衍射法：射线晶体衍射法：85.3%85.3%v核磁共振波谱：核磁共振波谱：14.7%14.7%v电镜三维

2、重构、各种光谱技术、显微电镜三维重构、各种光谱技术、显微 技术和计算机模拟技术和计算机模拟 l 1895年年11月月8日日,德国物德国物理学家，理学家，50岁的伦琴在岁的伦琴在自己的实验室中偶然发自己的实验室中偶然发现现 一种从阴极射线管一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，中辐射出的新型射线，由于对管子发出的由于对管子发出的“东东西西”性质不确定，伦琴性质不确定，伦琴就把这种射线命名为就把这种射线命名为“X射线射线”。图片出处:伦琴实验室伦琴实验室人类第一张人类第一张X光照片光照片图片出处:伦琴妻子之手伦琴妻子之手 1896年年1月月23日伦日伦琴将这一重大发现在维琴将这一重大发现在维尔兹堡物

3、理医学会上报尔兹堡物理医学会上报告。告。Kolliker教授提议教授提议将该射线命名为将该射线命名为“伦琴伦琴射线射线”,但伦琴却说但伦琴却说“我还没有彻底解释这我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还种射线的发生现象，还是称它为是称它为X射线最恰射线最恰当。当。”威廉威廉康拉德康拉德伦琴伦琴 Wilhelm Conrad Rntgenl1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有17封集中推荐他。伦封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处 X射线本质射线本质 X射线是一种短波长射线是一种

4、短波长(0.00510nm)、高能量高能量(2.5105 1.2102eV)的电磁波。的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。l 一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，射线的真空管，K是发射电子的热阴极，是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极使电子流加速，向阳极A撞击而产生撞击而产生X射线。射线

5、。AX射线衍射射线衍射l1912年年Max von Laue发现发现X射线具有衍射线具有衍射的现象。（射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）年的诺贝尔物理学奖）图片出处图片出处:劳厄的实验装置劳厄的实验装置 图片出处图片出处:X X射线晶体结构分析基本原理射线晶体结构分析基本原理 l X射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象l X射线衍射现象利用射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。l 当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每

6、个原子使射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。l 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。的堆积、有序或无序的排列等。1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.agrees well with structure特点m/z较分子离子小，碎片离子峰出现在分子离子峰的左侧。2、蛋白质结晶和晶体生长圆二色

7、性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性1H-1H COSY、1H-15N HSQC椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成3、衍射数据收集和处理X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。核磁共振法中几个常用的参数目前核磁共振成象技术已能以活人

8、为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。（2）透析法(Dialysis)74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。xa=80%,2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构X X射线通过红宝石晶体射线通过红宝石晶体(a)a)和硅单晶体和硅单晶体(b

9、)b)所拍摄的劳厄斑所拍摄的劳厄斑图片出处图片出处:劳伦斯劳伦斯布拉格布拉格(Lawrence Bragg)因在用因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献献,亨利亨利布拉格（布拉格（William Henry Bragg）和劳伦和劳伦斯斯布拉格（布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。年的诺贝尔物理学奖。图片出处图片出处 图片出处图片出处http:/nobelprize.org/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html l 20世纪世纪60年代解析一个蛋白

10、质结构可以获年代解析一个蛋白质结构可以获 得诺贝尔奖；得诺贝尔奖；l 20世纪世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻；为轰动世界的新闻；l 20世纪世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；l 20世纪世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；l 今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。

11、蛋白质结构解析的发展蛋白质结构解析的发展饶子和院士饶子和院士HIV基质蛋白基质蛋白 SARS射线衍射用于蛋白质结构的测定射线衍射用于蛋白质结构的测定l1954年伯纳尔年伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片。酶晶体衍射图片。l1957年肯特罗年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白完成肌红蛋白的的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构分辨率的蛋白质晶体结构图片出处:图片出处:肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型肌红蛋白的三维结构模型图片出处:图片出处:http:/1959年佩鲁茨年佩鲁茨(Perute)完成血完成血红蛋白红蛋白0.55分辨分辨率的

12、晶体结构率的晶体结构图片出处:血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构 模型模型图片出处 血红蛋白分子就是由二个由血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的亚基和二个由亚基和二个由146个氨基酸个氨基酸残基组成的残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。白分子严密的空间构象。由于测定出蛋白质的精细结构由于测定出蛋白质的精细结构,两位

13、英国科两位英国科学家学家M.F.M.F.佩鲁茨和佩鲁茨和J.C.J.C.肯德鲁获得肯德鲁获得19621962年的诺年的诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。图片出处：图片出处：1997年年,核小体八组蛋白结构核小体八组蛋白结构 2004年年,菠菜捕光复合物菠菜捕光复合物LHC-II2005年，线粒体膜蛋白复合物年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构精细结构X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖施一公抗癌抗乙肝病毒新药施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期，进入临床二期核磁共振测

14、深是MRI技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象所谓三维电镜重构是指通过样品的一个或多个投影图得到样品中各组成部分之间的三维关系。这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基；目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或

15、组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。org/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告。（2）透析法(Dialysis)1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像测定蛋白质结构的意义2102eV)的电磁波。如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。核

16、磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)，电子显微镜在三维电镜重构技术中起着十分重要的作用，电镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上有着特殊的优势。（1）批量结晶法（Batch crystallization）74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。蛋白质蛋白质X X射线晶体结构测定程序射线晶体结构测定程序 l 1、样品制备、样品制备 l 2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 l

17、 3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理 l 4、位相求解、位相求解 l 5、模型建立和修正、模型建立和修正 1、样品制备、样品制备 l大量表达、分离和纯化目标蛋白大量表达、分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于一般要求纯度大于97%，浓度达到浓度达到5mg/ml以上。以上。2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出积起来形成晶体析出 蛋白质晶体生长的影响因素蛋白质晶体生长的影响因素l 物理因素温

18、度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介物理因素温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等 l 化学因素化学因素pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等l l 生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和等

19、电点等称性、蛋白质的稳定性和等电点等 蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batch crystallization）（2）透析法）透析法(Dialysis)（3）液相扩散法液相扩散法(Liquid diffusion)（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion）（5）蛋白质结晶新方法蛋白质结晶新方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batch crystallization）l通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以

20、产生和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。溶液中结晶。（2）透析法）透析法(Dialysis)l利用半透膜允许小分子透过而大分子不能利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋白质晶体的常用方法。养蛋白质晶体的常用方法。（3）液相扩散法液相扩散法(Liquid diffusion)l利用液相平衡原理而设计

21、的。由于蛋白质在利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。饱和，从而促使晶核形成。（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion）l把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液在一个密闭体系内，两种浓

22、度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制一般由高速电子撞击金属产生。质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。xc=2

23、0%因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。动力学全精（DER）研究技术是将两个核磁共振光谱和分子动力学结合起来的一种方法。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像.1959年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.特点m/z较分子离子小，碎片离子峰出现在分子离子峰的左侧。Kolliker教授提议将该射线命名为“伦琴射线”,但伦琴却说“我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是称它为X射线最恰当。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的

24、质量差，识别相应的氨基酸残基；Wilhelm Conrad RntgenWilhelm Conrad RntgenX射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。（5）结晶新方法结晶新方法Nucleant 生物玻璃生物玻璃晶体初步鉴定晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等偏光显微镜观察、染色、电泳等3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理

25、l第三代同步辐射光源的应用使得用第三代同步辐射光源的应用使得用2040 um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实实l目前世界上比较著名的同步辐射工作站有目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个多个APS（USA）;ESRF（France）;SPring8（Japan）上海同步辐射中心上海同步辐射中心同步辐射光源同步辐射光源晶体收集和储存晶体收集和储存液氮气冷技术4、位相求解、位相求解 1.分子置换法分子置换法(MR)2.多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)3.多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)实验中经常联合使用实验中经常联合使用分子置换法分子

26、置换法(MR)l分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。体各个衍射点的相角的方法。多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)l在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如原子如Pb和和Hg等作为标志原子，制备出重等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射胞中的坐标，根据坐标

27、计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。质分子在各个衍射中的位相。多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)l利用同步辐射波长连续可变的特点，使用利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。的多套数据，并解出结构。5、模型建立和修正、模型建立和修正l晶体学晶体学R因子一般要求达到因子一般要求达到0.2以下以下l键长偏差大约为键长偏差大约为0.015l键角偏差约为键

28、角偏差约为3l二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制分布受到立体化学的限制l XRay晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法l 优点分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构 l 缺点只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息v 成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。v 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是核磁

29、共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。v目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。为一种引人注目的癌症早期诊断技术。NMRNMR核磁共振技术（核磁共振技术（NMR）v1946年美国年美国斯坦福大学斯坦福大学的的F.Bloch和哈佛大学的和哈佛大学的两个研究两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获小组首次独立观察

30、到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。v1983年年，瑞士科学家，瑞士科学家Kurt WKurt Wthrichthrich教授实验室首次运用教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液构多肽的溶液构象象.发明了利用核磁共振发明了利用核磁共振(NMR)NMR)技术测定溶液中生物大分子三维技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了结构的方法获得了20022002年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 v74岁的美国科学家保罗岁的美国科学家保罗劳特布尔和劳特布尔和70岁的英国科学家彼岁的英国科

31、学家彼得得曼斯菲尔德为曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主诺贝尔医学奖的得主 NMR基本原理基本原理核 磁 共 振核 磁 共 振(N u c l e a r N u c l e a r Magnetic Resonance)Magnetic Resonance)，就是处于某个静磁场中的就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时的射频磁场作用时,共振共振吸收某一特定频率的射频吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。辐射的物理过程。核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪核磁共振波谱是测量原子核对核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射射频辐射(约约4 4 600MHz)60

32、0MHz)的吸收，的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能这种吸收只有在高磁场中才能产生。产生。15核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪 核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪1永久磁铁：提供外磁场，永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。扫场线圈。2 射频振荡器：线圈垂射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。率的电磁辐射信号。60MHz或或100MHz。3 射频信号接受器（检测射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能辐射频率相匹配时，发生能级

33、跃迁，吸收能量，在感应级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。线圈中产生毫伏级信号。4样品管：外径样品管：外径5mm的玻的玻璃管璃管,测量过程中旋转测量过程中旋转,磁场磁场作用均匀。作用均匀。如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。l 瑞士科学家库尔特瑞士科学家库尔特维特里希则发明了维特里希则发明了“利用核磁共振技术测定溶利用核磁共振技术测定溶液中生物大分

34、子三维结构法液中生物大分子三维结构法”。这种方法的优点是可对溶液中的蛋。这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析白质进行分析,进而可对活细胞中的蛋白质进行分析进而可对活细胞中的蛋白质进行分析,能获得能获得“活活”蛋白质的结构蛋白质的结构,其意义非常重大。其意义非常重大。l 这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据据此就可以推知房屋的结构。维特里希选择生物大分子中的质子此就可以推知房屋的结构。维特里希选择生

35、物大分子中的质子(氢原氢原子核子核)作为测量对象作为测量对象,连续测定所有相邻的连续测定所有相邻的2 2个质子之间的距离和方个质子之间的距离和方位位,这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。核磁共振法中几个常用的参数核磁共振法中几个常用的参数l化学位移化学位移 l耦合常数耦合常数 lNOE（核欧沃豪斯效应）信号强度（核欧沃豪斯效应）信号强度 l谱峰面积谱峰面积 l弛豫时间弛豫时间 1.化学位移化学位移 l 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；低场；值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰值

36、越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。出现在高场。2.耦合常数耦合常数 核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数自旋自旋耦合常数,用用J表示。耦合常数用表示。耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小。来表征两核之间耦合作用的大小。J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。

37、布的因素有关。3.NOE信号强度信号强度 l当分子内有两个空间距离小于当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效核欧沃豪斯效应应（NOE）。）。4.谱峰面积谱峰面积 l谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来

38、做定量分析的基础。可用来做定量分析的基础。5.弛豫时间弛豫时间 l原子核从激化的状态回复到平衡排列状态原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。时间。l自旋晶格弛豫处于高能态的氢核，把能量自旋晶格弛豫处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。转给周围的分子，回到低能态。l自旋自旋弛豫自旋自旋弛豫 两个进动频率相同，进动取两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。相互交换能量，改变进动方向。二维核磁共振二维核磁共振(2DNMR）NMR

39、可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到等就需要用到2DNMR，它是它是2个频率变量的函数，吸收个频率变量的函数，吸收峰对峰对2个频率变量作图。个频率变量作图。1H-1H COSY、1H-15N HSQC 多维核磁共振多维核磁共振v1H，13C，15N核

40、之间的化学键连接来得到核磁共振核之间的化学键连接来得到核磁共振相关信号。相关信号。CBCANH、HNCO、HCCH-COSY v核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部的图像，就要将的图像，就要将不同梯度不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过的磁场加以结合，即改变穿过样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像后就得到样本内部空间的三维图像 核磁共振技术的应用核磁共振技术的应用l早期核磁共振主要用于对核结构和性质的早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁

41、矩、电四极距、及核自研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等旋等l后来广泛应用于分子组成和结构分析，生后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面诊断、产品无损监测等方面19851985年年,维特里希等人公布了第一次利用维特里希等人公布了第一次利用NMR NMR 法测定的溶法测定的溶液中蛋白质液中蛋白质蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂IIA(proteinase IIA(proteinase inhibitor IIA)inhibitor IIA)的结构的结构 NMR图谱得到的蛋白质三维结构图谱得到的蛋白质三维结构

42、from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院 NMR的非破坏性使得的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶晶体衍射互为补充体衍射互为补充.核磁共振成像核磁共振成像 基本原理是将人体置于特殊的磁场中，用无线电基本原理是将人体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量

43、释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像获得图像.核磁共振测深核磁共振测深核磁共振测深是核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。信息。优优 缺缺 点点v优点优点：可以在水溶液或：可以在水溶液或有机相中研究生物大分子有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改结构，研究溶液条件的

44、改变对生物大分子三维结构变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内的影响以及生物大分子内部动力学的特点部动力学的特点v缺点缺点：分辨率不高。目：分辨率不高。目前，前，NMR只能用于测定只能用于测定小分子和中型蛋白质的小分子和中型蛋白质的结构结构from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤法测定蛋白质结构的基本实验步骤:1、样品制备，一般应采用样品制备，一般应采用液态液态样品样品，CCl4溶解溶解2、一维一维NMR实验实验3、二维二维NMR实验实验4、三维三维NMR实验实验5、有的还要做四维有的还要做四维NMR实验实验vNMR法一般只能解析相对较小的

45、蛋白质，法一般只能解析相对较小的蛋白质，X-射射 线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。v有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。n X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些但它们都存在一些不足。不足。n X射线晶体衍射技术射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂

46、的生物大分子蛋白质而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。来说，比较难以得到所需的晶体结构。n 核磁共振技术核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。显得比较复杂。l因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法的方法l现代光谱技术现代光谱技术l三维电镜衍射技术三维电镜衍射技术l动力学全精研究技术动力学全精研究技术一、现代光谱技术一、现代光谱技术l除传统的紫外可见差光谱法和荧光光除传统的紫外可见差光谱

47、法和荧光光谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用。发挥着重要的作用。圆二色谱圆二色谱（Circular Dichroism，CD）l 圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。、快速而又较准确的方法。l 圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。光率的不同来分析蛋白质的结构。l 1969年，年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白用圆二色光谱数

48、据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。白质空间结构的报道逐渐增多。平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光l 平面偏振光指振动方向在同一平面内的电磁波。平面偏振光指振动方向在同一平面内的电磁波。l 圆偏振光当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相圆偏振光当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差相差1/4波长波长(90)时，其合成矢量绕光传播方向旋时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端轨末端轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电

49、场矢量方向顺迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转的则称左圆偏振光。的则称左圆偏振光。l 椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成圆二色性和圆二色谱圆二色性和圆二色谱l 圆二色性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活圆二色性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性是圆二色性l 光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振

50、幅差，从介质出来的样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示l 圆二色谱指椭圆度圆二色谱指椭圆度(或比椭圆度等或比椭圆度等)与波长的关系与波长的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。，它在本质上与旋光色散谱是一样的。圆二色谱的应用圆二色谱的应用l在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定生物大分子的空间结构。定生物大分子的空间结构。l 生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在通过圆二色谱测定和计算能够了