基因诊疗和基因治疗培训课件1.ppt

1、基因诊疗和基因治疗基因诊疗和基因治疗基因诊断基因诊断 用分子生物学技术对生物体的用分子生物学技术对生物体的DNADNA序列序列及其产物（及其产物（RNARNA和蛋白质）进行定性、定量和蛋白质）进行定性、定量分析，为疾病诊断提供依据。分析，为疾病诊断提供依据。基因诊断的前提基因诊断的前提 已明确疾病表型与基因型的关系已明确疾病表型与基因型的关系 2基因诊疗和基因治疗 基因诊断包括定性和定量分析基因诊断包括定性和定量分析lDNADNA、RNARNA或蛋白质水平变化，如病毒基或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；因表达水平从

2、低到高；l基因结构变化，如点突变引起基因失活、基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。染色体转位引起基因异常激活或灭活。3基因诊疗和基因治疗 基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性4基因诊疗和基因治疗基因诊断的基本技术流程基因诊断的基本技术流程样品抽提样品抽提DNARNAcDNAPCRPCR扩增扩增分子杂交分子杂交反转录反转录合成寡核苷酸引物合成寡核苷酸引物制备和标记探针制备和标记探针杂交信号检测杂交信号检测5基因诊疗和基因治疗基因诊断中常用的分子生物学技术基因诊断中常用的分子生物学技术 核酸分

3、子杂交核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）DNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）生物芯片（生物芯片（biochips）Western免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 6基因诊疗和基因治疗PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用 RT-PCRRT-PCR 荧光定量荧光定量PCRPCR 多重多重-PCR-PCR PCR-ASOPCR-ASO（等位基因特异性

4、寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸探针法）探针法）PCR-SSCPPCR-SSCP（单链构象多态性分析）单链构象多态性分析）PCR-RFLPPCR-RFLP（限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性分析）分析）7基因诊疗和基因治疗 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR8基因诊疗和基因治疗PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）等位基因特异性寡核苷酸探针法）N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM9基因诊疗和基因治疗 单链构象多态性分析单链构象多态

5、性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNADNA的突变造成的突变造成DNADNA片段中碱基序列不片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的中的构象不同构象不同（单链构象多态性），利用（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。离开来。10基因诊疗和基因治疗PCR-SSCPPCR-SSCP分析原理示意分析原理示意11基因诊疗和基因治疗 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment

6、 length polymorphism,RFLP）由于由于DNADNA变异产生变异产生新的酶切位点新的酶切位点或原有的或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCRPCR进行检测进行检测。12基因诊疗和基因治疗ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoREcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化13基因诊疗和基因治疗左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断

7、研究14基因诊疗和基因治疗生物芯片生物芯片（biochips）基因芯片（基因芯片（gene chipsgene chips）蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(protein chip)15基因诊疗和基因治疗基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法方法 优点与问题优点与问题 解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPR

8、FLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛可自动化，但不适宜广泛使用使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜效率高，成本高，不适宜广泛使用广泛使用选择合适的芯片选择合适的芯片16基因诊疗和基因治疗遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases17基因诊疗和基因治疗（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断-ASO杂交法杂交法2.2.HBS的限制性

9、内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 18基因诊疗和基因治疗 正常的（正常的（N N）的）的ASOASO探针探针：5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（突变的（M M）的）的ASOASO探针探针：5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASOASO杂交法杂交法19基因诊疗和基因治疗斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASOASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变

10、突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子20基因诊疗和基因治疗5 3 正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)5 3 突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstMst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析目目 录录21基因诊疗和基因治疗0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目 录录22基因诊疗和基因治疗3.HBS3.HBS的的

11、PCR-RFLPPCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker23基因诊疗和基因治疗传染病的基因诊断传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases24基因诊疗和基因治疗 一、病毒性疾病一、病毒性疾病 甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAVHAV）HAVHAV

12、系系RNARNA病毒，利用病毒，利用RT-PCRRT-PCR技术可从粪便中检测出技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组甲型肝炎病毒的基因组RNARNA。乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）设计保守区序列引物，扩增各型设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNAHBV DNA片段；设计片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNAHBV DNA，以便分型。，以便分型。丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）HCVHCV为正链为正链RNARNA病毒，先反转录成病毒，先反转录成cDNAcDNA，再进行巢式，再进行巢式PCRPCR检测检测HCVHCV。25基因

13、诊疗和基因治疗二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用先设计一对特异性引物，用PCRPCR技术扩技术扩增出一增出一383 bp383 bp序列，再用探针杂交，灵敏序列，再用探针杂交，灵敏度可达到度可达到100100个细菌水平。个细菌水平。幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HPHP）主要采用主要采用PCRPCR技术：检测技术：检测HPHP染色体染色体DNADNA特异片段；检测特异片段；检测HPHP尿素酶尿素酶A A基因；用基因；用PCR-RFLPPCR-RFLP鉴别鉴别HPHP菌株。菌株。26基因诊疗和基因治疗肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagno

14、sis of Malignant Tumors27基因诊疗和基因治疗一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 28基因诊疗和基因治疗一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1 1原癌基因的检测原癌基因的检测 rasras 基因家族基因家族由由H-rasH-ras、K-rasK-ras和和N-rasN-ras组成。最组成。最常见的突变是第常见的突变是第1212、1313、5959或第或第6161位密码子的点突变。位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-rasK-ra

15、s突变为主，如第突变为主，如第1212位密码子突变，由编码甘氨酸的位密码子突变，由编码甘氨酸的GGTGGT突变为突变为TGTTGT、GTTGTT或或GATGAT，少数突变为，少数突变为GCTGCT。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-N-rasras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-rasH-ras突变为主。突变为主。29基因诊疗和基因治疗 PCRPCR及及PCR-SSCPPCR-SSCP分析：分析：扩增扩增ras ras 基因第基因第1212位密位密码子点突变部位，再用码子点突变部位，再用SSCPSSCP技术进行分析，

16、或技术进行分析，或者直接测序确定患者者直接测序确定患者rasras原癌基因的点突变。原癌基因的点突变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASOASO）：）：检测检测rasras基因第基因第1212位密码子点突变。位密码子点突变。2.2.ras ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法30基因诊疗和基因治疗3 3抑癌基因抑癌基因p53p53的检测的检测 p53p53基因以密码子第基因以密码子第175175位、第位、第248248位、第位、第249249位、位、第第273273位及位及 第第282282位点突变率最高。在结直肠位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可

17、见异常的癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53p53基因蛋白。基因蛋白。p53p53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （1 1）PCR-SSCPPCR-SSCP分析技术分析技术 （2 2）DNADNA序列分析序列分析 （3 3）PCR-RFLPPCR-RFLP分析分析31基因诊疗和基因治疗基因治疗基因治疗Gene Therapy32基因诊疗和基因治疗 基因治疗基因治疗 指将目的基因通过基因转移技术（病毒指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用

18、。产物对疾病起治疗作用。33基因诊疗和基因治疗基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somatic cell)基基因治疗因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代34基因诊疗和基因治疗 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略35基因诊疗和基因治疗 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacement）定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，定位重组，导

19、入的正常基因导入的正常基因，以置换基因组内原，以置换基因组内原有的缺陷基因。有的缺陷基因。目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。36基因诊疗和基因治疗转导基因的载体与基因组转导基因的载体与基因组DNADNA具有相同具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。交换。基因同源重组技术又称为基因同源重组技术又称为基因打靶基因打靶（gen

20、e targeting)基因同源重组技术基因同源重组技术37基因诊疗和基因治疗（二）（二）基因添加基因添加（gene augmentation）定义定义:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型:n在有缺陷基因的细胞中在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目

21、的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。38基因诊疗和基因治疗（三）基因干预（三）基因干预（gene interference）定义：定义：采用特定的方式采用特定的方式抑制某个基因的表达抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。表达，以达到治疗疾病的目的。39基因诊疗和基因治疗 定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生，诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，效应，从而达到

22、清除肿瘤细胞的目的。从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy)40基因诊疗和基因治疗自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 41基因诊疗和基因治疗 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHCMHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。环境中的抗癌免疫反应。42基因诊疗和基因治疗二、基因转移技术二、基因转移技术 43基因诊疗和基因治疗基因治疗的两种途

23、径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞44基因诊疗和基因治疗 基因转移基因转移(gene transfer)技术技术 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移45基因诊疗和基因治疗反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 46基因诊疗和基因治疗 反转录病毒载体的特点反转录病毒载体的特点 1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质反

24、转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细高效地进入靶细胞胞。2)前病毒通过前病毒通过LTRLTR高效整合至靶细胞基因组中，高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的有利于外源基因在靶细胞中的永久表达永久表达。3)病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，养的上清液中，易于分离制备易于分离制备。47基因诊疗和基因治疗 反转录病毒载体的主要缺点反转录病毒载体的主要缺点 1 1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；险；2 2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 7

25、kbkb以下以下的外源基因。的外源基因。48基因诊疗和基因治疗 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)adenovirus)载体载体 腺病毒是双链腺病毒是双链DNADNA病毒。它通过受体介病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整不整合合进入宿主细胞基因组中。进入宿主细胞基因组中。49基因诊疗和基因治疗50基因诊疗和基因治疗腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转

26、导与细胞分裂无关；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 7.5 kbkb外源基因。外源基因。51基因诊疗和基因治疗 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l靶向性差。靶向性差。l不能整合不能整合到靶细胞的基因组到靶细胞的基因组DNADNA中。分裂增中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，而丢失的机会增多，表达时间相对较短表达时间相对较短。52基因诊疗和基因治疗（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 单链线状单链线状DNADNA缺陷

27、型病毒。其基因组缺陷型病毒。其基因组DNADNA小于小于5 5kbkb，无包膜，外形为裸露的无包膜，外形为裸露的2020面体颗面体颗粒。粒。AAVAAV不能独立复制，只有在辅助病毒不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。建立溶源性潜伏感染。AAV Virus Particles53基因诊疗和基因治疗腺病毒相关病毒载体（腺病毒相关病毒载体（AAVAAV）的特点）的特点l 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；l 病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共

28、存；l 若细胞受刺激，表达应激基因，使若细胞受刺激，表达应激基因，使AAVAAV病毒复制；病毒复制；l 产生子代病毒并释放，又感染新的产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。细胞，建立新的潜伏状态。54基因诊疗和基因治疗 AAVAAV载体的缺陷载体的缺陷 AAVAAV载体容量小，目前最多只能容纳载体容量小，目前最多只能容纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比反转录病毒载体低感染效率比反转录病毒载体低,在在40%40%-80%80%的成人中存在过感染的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。55基因诊疗和基因治疗常用基因治疗载体常用基因治疗载

29、体 整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反 转 录 病反 转 录 病毒毒 载载体体随机整合，随机整合，效率高效率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺 病 毒 载腺 病 毒 载体体不整合，可不整合，可能丢失能丢失不致病不致病分裂细胞、分裂细胞、非 分 裂 细非 分 裂 细胞胞 腺 相 关 病腺 相 关 病毒载体毒载体定 点 整 合定 点 整 合(19(19号染色号染色体特定区域体特定区域)不致病不致病分裂细胞、分裂细胞、非 分 裂 细非 分 裂 细胞胞5kb5kb7.5kb7.5kb56基因诊疗和基因治疗 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系

30、统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自混合后，可以自动形成包埋外源动形成包埋外源DNADNA的脂质体，与细胞一起孵育，的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源即可通过细胞内吞作用将外源DNADNA转移至细胞内，转移至细胞内，并进行表达。并进行表达。脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。低廉。57基因诊疗和基因治疗（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 多聚阳离子与细胞配体偶联，通过电荷多聚阳离子与细胞配体偶联，通过电荷

31、相互作用与带负电荷的相互作用与带负电荷的DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围，包围，配体暴露于表面。配体暴露于表面。该复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞该复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源饮，从而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。59基因诊疗和基因治疗受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图60基因诊疗和基因治疗 （3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 将基因直接注入动物体内，表达基因产物。将基因直接注入动物体内，表达基因产物。如将促进心脏血管生长的基因直接注入实如将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增验鼠的心脏，可使其心

32、脏壁内毛细血管增加加30%30%40%40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病基因，可产生血友病所需的凝血因子所需的凝血因子 。61基因诊疗和基因治疗 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点

33、；逆转的缺点；p基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。62基因诊疗和基因治疗三、基因干预三、基因干预 （gene interference）63基因诊疗和基因治疗（一）反义（一）反义RNARNA（antisense RNA）利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因表对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RN

34、ARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNARNA的重组质粒的重组质粒，将，将这些质粒转入细胞中，转录出反义这些质粒转入细胞中，转录出反义RNARNA而发挥而发挥作用。作用。64基因诊疗和基因治疗（二）干扰（二）干扰RNARNA RNA干扰干扰（RNA interference，RNAi）是一种由是一种由双链双链RNARNA诱发的基因沉诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链默现象。在此过程中，与双链RNARNA有同有同源序列的源序列的mRNAmRNA被降解，从而抑制该基因被降解，从而抑制该基因的表达。的表达。65基因诊疗和基因治疗RNARNA干扰的

35、机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有2 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性）小干扰性RNARNA（siRNA）（2 2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为称为RNARNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与siRNA有同源序列的有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该并在特异的位点将该mRNA切断切断 长双链长双链RNARNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNARNA特异性核酸酶特异性核酸酶DicerDicer切成切成21

36、21-2323个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNA，称称为小干扰性为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）66基因诊疗和基因治疗RNARNA干扰机制示意图干扰机制示意图 67基因诊疗和基因治疗1.体外化学合成体外化学合成;2.2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。定地生成。siRNAsiRNA的产生的产生68基因诊疗和基因治疗四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 69基因诊疗和基因治疗 腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)PNP)缺乏症缺乏症 珠蛋白生成障

37、碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)Lesch-Nyhan)综合征综合征 家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 囊性纤维化病囊性纤维化病 (一一)遗传病基因治遗传病基因治疗疗70基因诊疗和基因治疗（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；基因以抑制癌症的发生、发展和转移；（2 2）抑制癌基因

38、的活性，通过干扰癌基因的转）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；录和翻译，发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。(5)(5)提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏 基因治疗；基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。71基因诊疗和基因治疗（三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒

39、性疾病的基因治疗研究 病毒感染人体后可能急性发病，还可病毒感染人体后可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。它毒还是造成先天畸形的重要因素之一。它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的关联。病也存在一定的关联。临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段。然缺乏有效的治疗手段。72基因诊疗和基因治疗 1 1调节机体免疫应答调节机体免疫应答 （1 1）将将细胞因子细胞因子(如干扰素、白细胞介素等如干扰素、白细胞介素等)的基因，

40、导入机体免疫细胞，激活免疫细的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染的体液免疫应答，促进机体清除病毒感染的细胞和游离病毒。细胞和游离病毒。73基因诊疗和基因治疗2 2.抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的复制周期的各个环节来设计的（1 1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。特异性结合。（2 2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。）干扰病毒基因组的转录起始和调控。（3 3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。（4 4）RNARNA干扰技术。干扰技术。74基因诊疗和基因治疗五、基因治疗的问题与展望五、基因治疗的问题与展望 缺乏高效缺乏高效、靶向性的基因转移系统靶向性的基因转移系统 缺乏有效的治疗靶基因缺乏有效的治疗靶基因 真核生物表达调控机制未完全阐明真核生物表达调控机制未完全阐明 缺乏准确的疗效评价缺乏准确的疗效评价75基因诊疗和基因治疗