遗传病的诊断课件.ppt

1、Diagnosis of Genetic DiseaseDiagnosis of Genetic Disease遗传病的诊断1教学要求教学要求 1 1遗传病的临床诊断：遗传病的临床诊断：病史采集；症状和体征病史采集；症状和体征；系谱系谱分析分析。2 2细胞遗传学检查：细胞遗传学检查：染色体检查染色体检查，FISHFISH技术；技术；性染色性染色质检查。质检查。3 3生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。4 4基因诊断基因诊断：基因诊断的定义和特点基因诊断的定义和特点；基因诊断的方基因诊断的方法法：限制性片段长度多态性分析、限制性片段长度多态性分析、So

2、uthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的检测、基因缺失的检测、检测、基因缺失的检测、RCR-RFLPRCR-RFLP）、）、DNADNA测序、测序、DNADNA芯芯片、荧光原位杂交等的片、荧光原位杂交等的原理原理、操作和应用。、操作和应用。遗传病的诊断2产前诊断产前诊断 (prenatal diagnosis)植入前诊断植入前诊断 (preimplantation diagnosis)症状前诊断症状前诊断 (presymptomatic diagnosis)现症病人诊断现症病人诊断 (sym

3、ptomatic diagnosis)遗传病的诊断3临床诊临床诊断断实验诊断实验诊断 病史采集病史采集 症状和体征症状和体征 遗传病系谱分析遗传病系谱分析 细胞遗传学检查细胞遗传学检查 生化检查生化检查 基因诊断基因诊断遗传病的诊断41 症状和体征症状和体征 2 系谱分析系谱分析 3病史采集病史采集遗传病的诊断5一、病史采集一、病史采集家族史：家族史：有无同种病史；有无同种病史；婚姻史：婚姻史：婚龄、婚次、配偶健康情况及是否近婚龄、婚次、配偶健康情况及是否近亲结婚；亲结婚；生育史：生育史：生育年龄、生育子女数目及健康状况生育年龄、生育子女数目及健康状况，有无流产、死产和早产史，有无流产、死产和

4、早产史。除应了解一般病史外，还应着重采集与遗传除应了解一般病史外，还应着重采集与遗传病家族聚集现象有关的以下项目：病家族聚集现象有关的以下项目：遗传病的诊断6二、症状和体征二、症状和体征遗传病有和其它疾病相同的症状和体征，往往又遗传病有和其它疾病相同的症状和体征，往往又有其本身有其本身特异性症侯群特异性症侯群，为诊断提供初步线索。，为诊断提供初步线索。遗传病的诊断7二、症状和体征二、症状和体征白化病白化病 并并 指指 多多 指指软骨发育不全软骨发育不全遗传病的诊断8二、症状和体征二、症状和体征 除了解现在的症状和体征外，还应注意了解除了解现在的症状和体征外，还应注意了解身身体发育快慢体发育快慢

5、、智力增进情况智力增进情况、性器官及第二性征性器官及第二性征发育状态发育状态等。等。皮肤纹理特征皮肤纹理特征的检查也可作为遗传的检查也可作为遗传病的辅助诊断指标。病的辅助诊断指标。遗传病的诊断9三、系谱分析三、系谱分析 记录遗传病家族史最好的方法是绘制系谱。记录遗传病家族史最好的方法是绘制系谱。系谱分析的意义系谱分析的意义 有效记录遗传病有效记录遗传病家族史家族史 确定遗传病确定遗传病遗传方式遗传方式 遗传咨询中个体遗传咨询中个体患病风险计算患病风险计算 基因定位基因定位中中连锁分析连锁分析遗传病的诊断10v系统性、完整性和可靠性系统性、完整性和可靠性v不规则显性、延迟显性、不规则显性、延迟显

6、性、从性显性等特殊现象从性显性等特殊现象 v新的基因突变新的基因突变v显性与隐性概念的相对性显性与隐性概念的相对性 注意问题注意问题同一遗传病采用的观察指同一遗传病采用的观察指标不同而得出不同的遗传标不同而得出不同的遗传方式，如镰状细胞贫血和方式，如镰状细胞贫血和镰状细胞症状。镰状细胞症状。遗传病的诊断11四、遗传数据库资源应用四、遗传数据库资源应用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)遗传病的诊断12四、遗传数据库资源应用四、遗传数据库资源应用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)遗传病的诊断13第二

7、节第二节 细胞遗传学检查细胞遗传学检查1 性染色质检查性染色质检查 2 染色体检查染色体检查 遗传病的诊断14取材：取材：视检查对象和目的而有所不同，通常主要取自外周视检查对象和目的而有所不同，通常主要取自外周血、皮肤、骨髓、胸、腹水、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞血、皮肤、骨髓、胸、腹水、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血等各种组织。和脐血等各种组织。体外细胞培养体外细胞培养制片：制片：秋水仙素处理，收获细胞、低渗、固定、滴片等过秋水仙素处理，收获细胞、低渗、固定、滴片等过程，制备染色体标本。程，制备染色体标本。显带显带核型分析核型分析一、染色体检查一、染色体检查遗传病的诊断15 不明原因的智力发育不

8、全、生长迟缓者不明原因的智力发育不全、生长迟缓者；先天性畸形（先天性畸形（包括两性内外生殖畸形）；包括两性内外生殖畸形）；性征发育异常及生育异常性征发育异常及生育异常：原发性闭经和女性不孕症；原发性闭经和女性不孕症；无精子症和男性不育症；无精子症和男性不育症；有反复多次早期流产史的妇女及其丈夫；有反复多次早期流产史的妇女及其丈夫；家族史家族史：家族中有染色体异常或先天畸形的个体。：家族中有染色体异常或先天畸形的个体。有较长时间、较大剂量射线或有较长时间、较大剂量射线或致畸致突变物质接触者；致畸致突变物质接触者；恶性肿瘤恶性肿瘤，尤其是恶性血液病患者。，尤其是恶性血液病患者。染色体检查（核型分析

9、）指征染色体检查（核型分析）指征遗传病的诊断16二、性染色质检查二、性染色质检查 X染色质和染色质和Y染色质染色质 适应症：两性畸形或性染色体数目异常疾病适应症：两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断，但仍需染色体检查确认。的诊断，但仍需染色体检查确认。遗传病的诊断17第三节第三节 生物化学检查生物化学检查 1、代谢产物分析、代谢产物分析 2、酶和蛋白质分析、酶和蛋白质分析 材料主要来源于血液和特定的组织、细胞，如材料主要来源于血液和特定的组织、细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞、肾、肠粘膜细胞等。肝细胞、皮肤成纤维细胞、肾、肠粘膜细胞等。产前诊断中常采集绒毛、羊水、脐带血和皮肤。产前诊断中常采集绒

10、毛、羊水、脐带血和皮肤。新生儿的筛查最常用的标本是新生儿的筛查最常用的标本是和和。遗传病的诊断18苯丙酮尿症苯丙酮尿症,PKU 酶活性检查酶活性检查PAH肝脏肝脏 血液滤片血液滤片苯丙氨酸苯丙氨酸 血血 FeCl3显色反应显色反应-绿色绿色苯丙酮酸苯丙酮酸尿液尿液例：例：遗传病的诊断19 19781978年，美国科学院院士美籍华裔科学家年，美国科学院院士美籍华裔科学家YW YW Kan(Kan(简悦威简悦威)和和DozyDozy应用液相应用液相DNADNA分子杂交成功地分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症的基因诊断，标志着检验进行了镰状细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。诊断进

11、入基因诊断时代。第四节第四节 基因诊断基因诊断(gene diagnosis)遗传病的诊断20第四节第四节 基因诊断基因诊断(gene diagnosis)基因诊断：基因诊断：利用利用分子生物学技术分子生物学技术，从，从DNA/RNADNA/RNA水平水平检测分析检测分析致病基因致病基因的的存在存在、变异变异和和表达状态表达状态从而对从而对疾病作出疾病作出诊断诊断的技术。的技术。一、基因诊断定义和特点一、基因诊断定义和特点A A、特异性强、特异性强B B、灵敏度高、灵敏度高特点特点C C、应用范围广、应用范围广D D、早期诊断、早期诊断遗传病的诊断21基因诊断概述基因诊断概述 人类基因组计划人

12、类基因组计划 基因结构基因结构 后基因组计划后基因组计划 基因功能基因功能基因诊断的两个支点：基因诊断的两个支点：遗传病的诊断22基因诊断的一般流程基因诊断的一般流程前提条件：先证者要有明确的临床诊断前提条件：先证者要有明确的临床诊断医学遗传咨询门诊医学遗传咨询门诊相关临床科室相关临床科室医生诊断医生诊断签署基因诊断知情同意书签署基因诊断知情同意书 抽取外周血抽取外周血2-3ml 基因检测基因检测 咨询临床医生咨询临床医生 遗传病的诊断23对基因检测结果的理解对基因检测结果的理解 找到功能性突变：支持临床诊断找到功能性突变：支持临床诊断 未找到功能性突变：不否定临床诊断未找到功能性突变：不否定

13、临床诊断遗传病的诊断24 临症诊断临症诊断家系先证者或患者家系先证者或患者 症状前诊断症状前诊断家系高危个体家系高危个体 产前诊断产前诊断家系高危胎儿家系高危胎儿遗传病的诊断25二、基因诊断基本方法二、基因诊断基本方法 1Southern印迹杂交印迹杂交|2聚合酶链反应分析聚合酶链反应分析 3DNA 测序测序|5荧光原位杂交荧光原位杂交 4.DNA 芯片芯片 遗传病的诊断26 分子印迹杂交分子印迹杂交(Southern blotting)(Southern blotting)的基本方法：的基本方法：DNADNA标本标本用用限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离各酶

14、解片段各酶解片段DNADNA转印至转印至硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜标记探针标记探针杂交杂交显影显影确定确定探针互补的每条探针互补的每条DNADNA带的位置，以确定在众多酶解产物中含带的位置，以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的某一特定序列的DNADNA片段的位置和大小片段的位置和大小。1Southern印迹杂交印迹杂交 遗传病的诊断272聚合酶链反应分析聚合酶链反应分析 PCR原理示意图原理示意图 变性变性退火退火延伸延伸遗传病的诊断28（1）产物探针检测）产物探针检测 ASO探针探针 等位特异性的寡核苷酸等位特异性的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide

15、，ASO)探针探针:当某一致病基因的当某一致病基因的突变位点的突变位点的性质性质以及突变位点以及突变位点两侧的碱基两侧的碱基序列序列都都明确明确的情形下，可以合的情形下，可以合成成ASOASO探针探针。ASO探针检测镰状细胞突变基因的示意图探针检测镰状细胞突变基因的示意图 /S S/S 遗传病的诊断29（2）产物构象变化检测）产物构象变化检测-SSCP|DNADNA单链构象多态性单链构象多态性(single strand (single strand conformation conformation polymorphisms,SSCPpolymorphisms,SSCP)：相相同长度的单链

16、同长度的单链DNADNA可因碱基序列不同可因碱基序列不同产生构象差异，在非变性聚丙烯酰胺产生构象差异，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为迁移率差别。凝胶电泳中表现为迁移率差别。|提取提取DNADNAPCRPCR扩增扩增产物变性产物变性电泳电泳|根据单链条带位置的改变判断该个体根据单链条带位置的改变判断该个体是否存在突变。是否存在突变。|并不是所有的碱基突变都会导致并不是所有的碱基突变都会导致SSCPSSCP，因此该方法不能鉴别所有突变。，因此该方法不能鉴别所有突变。SSCP电泳检测示意图电泳检测示意图 遗传病的诊断30 基因缺失时可导致靶基因缺失时可导致靶DNADNA模板的缺失，使用特异性模板

17、的缺失，使用特异性引物扩增时得不到相应的扩增产物，因此可以直引物扩增时得不到相应的扩增产物，因此可以直接检测缺失。接检测缺失。（3）PCR产物有无检测产物有无检测遗传病的诊断31RFLP连锁分析法连锁分析法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由于由于碱基变异碱基变异可能导致可能导致限制酶切点消失或新的酶限制酶切点消失或新的酶切位点切位点出现，引起不同个体出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶在用同一限制酶切割时，产生切割时，产生不同长度的不同长度的DNA片段片段，称，称 RFLP。（4）产物酶切检测）产物酶切检测-RFLP遗传病的诊断3

18、2nRFLPRFLP的主要步骤的主要步骤:DNADNA酶切酶切SouthernSouthern印记杂交分析印记杂交分析DNAPCR DNAPCR 酶切酶切电泳分析电泳分析n RFLPRFLP主要有以下两种类型：主要有以下两种类型：点多态性点多态性 序列多态性序列多态性 遗传病的诊断33正常人（正常人（HbAHbA）和镰状细胞贫血患者）和镰状细胞贫血患者（HbSHbS）珠蛋白基因的结构差异珠蛋白基因的结构差异 正常人（正常人（HbAHbA）和镰状细胞细胞）和镰状细胞细胞贫血患者（贫血患者（HbSHbS）珠蛋白基因珠蛋白基因DdeDde限制酶切点示意图限制酶切点示意图 珠蛋白基因珠蛋白基因DdeD

19、de限制酶切片段电泳结果限制酶切片段电泳结果遗传病的诊断34 1 2 1 516p13.2-pter人类人类珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇a地中海贫血缺失基因检测地中海贫血缺失基因检测遗传病的诊断35 PCR-RFLP检测基因缺失和插入的示意图检测基因缺失和插入的示意图 遗传病的诊断36案例案例9-2基因诊断分析基因诊断分析(P99)地贫的基因缺失的地贫的基因缺失的RFLP基因诊断基因诊断 正常对照正常对照遗传病的诊断373DNA 测序测序 DNA测序即测定测序即测定DNA的一级结构中碱基的顺序。的一级结构中碱基的顺序。包含特定位点的包含特定位点的PCR产物再作产物再作DNA测序，比较正测序，比较正

20、常基因与突变的序列，可检测出突变的碱基类型常基因与突变的序列，可检测出突变的碱基类型和位点。和位点。遗传病的诊断38DNA自动测序仪生成的序列自动测序仪生成的序列DNA自动测序仪采用自动测序仪采用4种不同颜色的荧光分别标记种不同颜色的荧光分别标记4种双脱种双脱氧核苷酸，基本实现了测序自动化。氧核苷酸，基本实现了测序自动化。遗传病的诊断39 概念：概念：基因芯片技术是基因芯片技术是DNADNA杂交探针与半导体工业技术相结杂交探针与半导体工业技术相结合的产物。将各种合的产物。将各种探针固定探针固定于支持物上后与于支持物上后与带有荧光标记的带有荧光标记的DNADNA样品分子进行样品分子进行杂交杂交，

21、通过检测每个探针分子的，通过检测每个探针分子的杂交信号杂交信号，进而获取被测样品中进而获取被测样品中DNADNA分子的分子的数量和序列信息数量和序列信息。该技术可用。该技术可用于大规模筛查由基因突变引起的疾病。于大规模筛查由基因突变引起的疾病。4.DNA 芯片芯片 遗传病的诊断40检测原理和步骤：检测原理和步骤：（1 1）制作芯片：根据疾病基因中的制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的核苷酸序列，合成突变位点区域的核苷酸序列，合成2020个核苷酸长的探针，将其固定于芯片个核苷酸长的探针，将其固定于芯片上，芯片上可固定成千上万个探针。上，芯片上可固定成千上万个探针。（2 2）从被测对象的细胞中

22、提取从被测对象的细胞中提取DNADNA，用酶切成较小的片段，对用酶切成较小的片段，对DNADNA作荧光标作荧光标记，并熔解成单链。记，并熔解成单链。（3 3）将样品滴加到芯片上并与芯片上将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交，凡是与探针互补的酶切的探针杂交，凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上，不能互补片段会固定于特定位置上，不能互补的片段会被洗脱掉。的片段会被洗脱掉。（4 4）对芯片上的荧光作扫描和分析对芯片上的荧光作扫描和分析。Gene screening using a DNA microarray.遗传病的诊断41 非放射性原位杂交非放射性原位杂交方法方法 用特殊用特殊荧光素标记

23、荧光素标记DNADNA探针探针，在染色体、细胞和组织切片标，在染色体、细胞和组织切片标本上进行本上进行DNADNA杂交，检测细胞内杂交，检测细胞内DNADNA或或RNARNA的特定序列存在与的特定序列存在与否。否。6荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH）遗传病的诊断42案例案例19-1 罗罗xx xx，女，女，3434岁，曾生育过一个智力低下患儿，现再次岁，曾生育过一个智力低下患儿，现再次妊娠，因惧怕再生同病患儿前来咨询。其患儿，男，妊娠，因惧怕再生同病患儿前来咨询。其患儿，男，6 6岁岁，智力低下，智力低下，IQIQ值值4242。染色体核型分析为。染色体核型分析为4646，XYXY，-14-1

24、4，+t(14q;21q)+t(14q;21q)。检查患儿父亲的核型正常；而母亲是平衡。检查患儿父亲的核型正常；而母亲是平衡易位携带者，核型为易位携带者，核型为4545，XX,-14,-21,+t(14q;21q)XX,-14,-21,+t(14q;21q)。脐脐血血FISHFISH分析结果如图。分析结果如图。21q探针对脐血间期细胞探针对脐血间期细胞FISH分析结果分析结果 遗传病的诊断43基因异常基因异常方方 法法探针、引物或限制酶探针、引物或限制酶基因缺失基因缺失基因组基因组Southern印迹杂交印迹杂交PCR扩增扩增缺失基因的探针缺失基因的探针引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或

25、在缺失部位内点点 突突 变变RFLP分析分析ASO杂交杂交PCR产物的多态性分析产物的多态性分析（RFLP、SSCP）突变导致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶正常和异常的正常和异常的ASO探针探针引物包括突变部位引物包括突变部位基因已知但基因已知但异异 常常 不不 明明基因内或旁侧序列多态性基因内或旁侧序列多态性（RFLP、AMPFLP，SSCP）连锁分析）连锁分析基因内或旁侧序列探针或引物基因内或旁侧序列探针或引物基因未知基因未知与疾病连锁的多态性，如与疾病连锁的多态性，如SSCP、AMPFLP连锁分析连锁分析RFLP位点单体型连锁分析位点单体型连锁分析与疾病连锁的多态位点探针与

26、疾病连锁的多态位点探针或引物或引物 遗传疾病的基因诊断方法遗传疾病的基因诊断方法遗传病的诊断44教学要求教学要求 1 1遗传病的临床诊断：遗传病的临床诊断：病史采集；症状和体征病史采集；症状和体征；系谱系谱分析分析。2 2细胞遗传学检查：细胞遗传学检查：染色体检查染色体检查，FISHFISH技术；技术；性染色性染色质检查。质检查。3 3生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。4 4基因诊断基因诊断：基因诊断的定义和特点基因诊断的定义和特点；基因诊断的方基因诊断的方法法：限制性片段长度多态性分析、限制性片段长度多态性分析、SouthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的检测、基因缺失的检测、检测、基因缺失的检测、RCR-RFLPRCR-RFLP）、）、DNADNA测序、测序、DNADNA芯芯片、荧光原位杂交等的片、荧光原位杂交等的原理原理、操作和应用。、操作和应用。遗传病的诊断45遗传病的诊断46