脊髓灰质炎病毒空斑试验课件.ppt

1、脊髓灰质炎病毒空斑实验细胞培养 试验前准备（4人/组）*无菌操作：套脚套，洗手，个人防护器材佩戴，包括：衣帽、口罩、手套。掌握微生物学无菌操作技术。酒精棉球，无菌镊子，记号笔等。无菌操作过程中要经常用无菌操作过程中要经常用75%酒精消毒手。酒精消毒手。开瓶盖前也用酒精棉球消毒该区域。开瓶盖前也用酒精棉球消毒该区域。试管、瓶子的上试管、瓶子的上1/4 1/3、移液管的下、移液管的下2/3部分不能触碰任何污染区域部分不能触碰任何污染区域 一、传代细胞系培养一、传代细胞系培养 1、优点：1)可以无限的传代。2)不少细胞系对病毒很敏感。3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

2、4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中可能会遭到支原体和病毒的污染。敏感宿主细胞敏感宿主细胞 二、传代细胞培养的条件要求二、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：23105个/ml(Hela 1:3 or 1:4)2）pH范围 最适，耐受 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37 昆虫细胞2830*培养基、分散液的使用 培养基：加入双抗使培养基双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；加入胎牛血清使其最终浓度为10%；加谷氨酰胺12ml于100ml培养基中（使用终浓度为14mmol/L）；用7.5%碳酸氢钠调整培养基为，备用。分散液：用7.5%碳酸氢钠调整胰蛋白酶溶液

3、为，备用。或直接使用0.02%EDTA作为分散液。*培养方法 1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。2）加入2ml 胰酶消化液或0.02%EDTA(先用5ml 0.02%EDTA 洗1次)，于37培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。EDTA要尽量甩干。3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中（1:3）*。再在每个小瓶中补充生长液至10ml15ml，然后置37培养箱培养，培养5 7天即可长成单层（培养板要做好标记）。*（1:3）：）：转入多孔培养板（6孔板）要计算加入量，3ml/孔。每人3孔。15ml/瓶3=45 ml/瓶（加16ml吹打，

4、扣除泡沫）。Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞正常细胞正常细胞单层细胞的分散 注意事项：若所用液体、器材未彻底灭菌，可导致细菌或真菌污染，细胞生长缓慢甚至停止、死亡。*Hanks液、病毒悬液、2MEM液体培养基的准备加入双抗使Hanks液双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；用7.5%碳酸氢钠调整Hanks液为用Hanks液或1MEM细胞培养基，将Polio V 1型口服疫苗悬液作系列稀释：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。*如果怀疑病毒悬液污染，可预先用如果怀疑病毒悬液污染，可预先用m滤膜过滤除菌。滤膜过滤除菌。操作步骤操作步骤取取5g5g

5、样品样品振荡振荡10min10min45ml45ml 1010-1-11010-2-21010-3-31010-4-41010-5-51010-6-62ml2ml2ml2ml2ml2ml加培养基加培养基2 23737孵育孵育2.0 h2.0 h，每，每15 min15 min摇动摇动1 1次。次。加入双抗使2MEM培养基（45）双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；加谷氨酰胺12ml于100ml培养基中（使用终浓度为14mmol/L）；加入胎牛血清使最终浓度为2%；用7.5%碳酸氢钠调整培养基为，备用。将2MEM液体细胞培养基（胎牛血清浓度为2%）与1%琼脂糖等量混合，保持在45

6、。病毒（病毒（PolioV）在传代细胞中的复制）在传代细胞中的复制 1、选长满单层的细胞，倒掉（吸出）培养液。2、接种病毒悬液 0.2 ml/孔，空白对照 加培养液0.2 ml/孔 3、置温箱中置37 吸附2 h，且每隔15 摇动一次。4、然后倒掉（吸出）接种病毒液，铺上45，含0.5%琼脂糖的维持液覆盖层，2 ml/孔，置室温30 min以上。5、凝固后倒置，于37 培养4872 h。*空斑观察计数 于每孔内加入2 ml甲醛固定20 min，然后甩下琼脂糖覆盖层，用自来水将孔内残渣轻轻冲洗干净。用1%结晶紫溶液覆盖底层，使瓶壁上的细胞着色10 min，自来水轻轻冲洗，即可观察细胞空斑并计数。

7、PFU：空斑形成单位(plaque-forming units)；P：某稀释度计数的空斑数；n：某稀释度平行培养瓶数；v：培养瓶接种的病毒液体积。VnPPPmlPFU1/321 稀释倍数End大肠杆菌大肠杆菌f2噬菌体空斑实验噬菌体空斑实验一、意义 由于大肠菌群的生物学特性与肠道病毒之间存在一定差异，因此用大肠菌群来指示经粪便污染水体的病毒学质量有其不足之处。有研究表明大肠杆菌噬菌体(Coliphage)f2是一种评价水源污染和水处理过程病毒杀灭效率的有希望的指示生物，其主要优点是：（1）大肠杆菌噬菌体(Coliphage)f2是RNA噬菌体，其核酸性质、粒子大小、pH稳定性等均与肠道病毒极为

8、接近。（2）大肠杆菌噬菌体经粪便排泄，在水和废水中存在的数目比肠道病毒多，其数量的季节变化也与肠道病毒相似。（3）对外界环境和氯、碘等消毒剂的抵抗力也与肠道病毒相似或略强一些。（4）大肠杆菌噬菌体的检测与计数等方法也较简易。二、原理 根据f2噬菌体感染大肠杆菌285宿主菌后，可在宿主细胞内增殖、最后裂解细胞的特性，将噬菌体适当稀释，再感染宿主细胞，并利用固体琼脂限制单个感染灶的无限扩散，而形成肉眼可见的空斑。一般而言，每个空斑即由一个噬菌体增殖裂解而成，因此可利用此原理定量检测样品中的噬菌体数量。病毒数量和感染性测定病毒数量和感染性测定1、蚀斑试验斑试验2、ID50 或或 TCID50 病毒感

9、染鸡胚、动物或细胞后，引起 50%发生死亡或病变的最小量。病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶（此区域细胞发生溶解），称蚀斑，蚀斑是由一个感染性病毒体复制形成的，称蚀斑形成单位，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀斑形成单位PFU来表示。三、试剂及培养基制备 略 实验分组：3人/组四、实验步骤大肠杆菌285宿主菌增菌培养：接种12个菌落至1020 ml营养肉汤液体培养基中，置37 培养1012 h，备用。融化2%营养琼脂固体培养基，将50 左右营养琼脂倒入平皿，1020 ml/皿，冷却凝固待用。融化小试管中1%营养琼脂固体培养基，置45 保温，待用。用无菌蒸馏水，将f2噬菌体悬液作系列稀释：1

10、0-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。对以上平皿，按上述稀释度编号，每个稀释度3皿平行。将不同稀释度f2噬菌体稀释液1 ml、285宿主菌悬液0.2 ml和约45，1%营养琼脂5 ml，混匀，倒入以上平皿，冷却。平皿倒置37 培养1624 h。观察透明空斑并计数。45，1%营养营养琼脂琼脂5 ml f2噬菌体稀释液噬菌体稀释液1 ml菌悬液菌悬液0.2 ml混匀混匀静置、冷却静置、冷却PlaquePFU：空斑形成单位(plaque-forming units)；P：某稀释度计数的空斑数；n：某稀释度平行培养瓶数；v：培养瓶接种的病毒液体积。VnPPPml

11、PFU1/321 稀释倍数 End操作步骤操作步骤称取称取10g10g土土样样振荡振荡10min10min90ml90ml9ml9ml9ml9ml9ml9ml9ml9ml 9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1010-1-11010-2-21010-3-31010-4-41010-5-51010-6-620ml20ml20ml20ml20ml20ml倒培养基倒培养基2 2CPE病毒培养时出现的CPE电泳（PAGE）鉴定轮状病毒（Rotavirus）实验第一次实验实验意义在腹泻病的病毒病因中，轮状病毒为主要病因，它占整个腹泻病的1/4。在经济发达国家，急性肠胃

12、炎住院的婴幼儿中约1/3-1/2以上是轮状病毒腹泻，而在发展中国家，轮状病毒为主要病因。急性腹泻的病因颇多，往往需要更准确的实验室诊断进行确诊，即从粪便中检测轮状病毒或其抗原。PAGE是轮状病毒腹泻分子流行病学调查和临床确诊常用的方法。原理轮状病毒RNA由11个片段的双链RNA组成，在一定的pH环境中，分节段的RNA带负电荷，由于电场力的作用，带负电荷的RNA片段向正极方向泳动，鉴于各RNA片段本身结构、带电荷不同，因此，在一定时间内各分子量不同的RNA片段泳动到聚丙烯酰胺凝胶板上特定的位置，形成各自的致密区带，经硝酸银染色，呈现出RNA区带电泳图型，从而使RNA片段得以分离和分析。实验步骤a

13、)提取RNA(供PAGE电泳用)1.用PBS制备10%的粪便悬液：0.25 g粪便加入2.25 ml PBS2.取10%粪便悬液250l于1.5 ml离心管（编号），加50l裂解液震荡器上混匀（3次）。3.37孵育30 min。临床样本：临床样本：1、3、4、54.加入4存放重蒸过的苯酚300l，震荡混匀（3次）。5.12000转/min，离心2 min。液体分层。6.吸出上层液体至另一小离心管中（同样编号），不要扰动中间相和下层液体，弃原离心管。7.加入氯仿300l，震荡混匀（3次）。8.12000转/min，离心2 min。液体分层。9.吸出上层液体至另一小离心管中（同样编号），不要扰动中

14、间相和下层液体，弃原离心管。10.重复49步骤12次11.加入-20保存的无水乙醇500l，再加入5 M NaCl 5l，盖紧小试管，倒转来回彻底混匀3次。-20静置过夜，或-70 2小时以上。加氯仿加氯仿加苯酚加苯酚取上层取上层混匀离混匀离心心混匀离混匀离心心取上层取上层第二次实验第二次实验转/min，离心1520 min。13.离心后立即倒掉液体，离心管倒立，让液体控干，下边垫吸水纸，然后将离心管直立，室温放置1530 min，待其干燥（让乙醇挥发）14.每管加入50l灭菌的双蒸水，溶解RNA，放-20保存，即为PAGE用RNAb)PAGE板的制备和电泳1.用酒精擦洗两块玻璃板、梳子，用纸

15、擦干净、凉干。组装固定两块玻璃板。2.封底胶：琼脂糖1 g，加热溶解在100 ml双蒸水，用融化的琼脂糖封住玻璃板的三个边，以防漏胶。3.制备分离胶：0.75 M Tris-HCl(pH 8.8)20 ml 0.1 M EDTA 0.4 ml 丙烯酰胺溶液（单体）13.3 ml 双蒸水 4.7 ml混匀，加入3%过硫酸铵1.6 ml，TEMED 70 l后迅速混匀，立即倒入玻璃板中间，离梳齿11.5 cm后终止，然后加入双蒸水，直立静置1h左右。制备浓缩胶前，倒掉双蒸水。2010年：年：1.4 ml+60 l Tris(Figure 3)is used to remove ammonia an

16、d amine contaminants and to keep the gel at a constant pH.Figure 3-Tris Molecule Figure 5-Acrylamide Molecule Figure 6-BIS Molecule Figure 7-Ammonium Persulfate(APS)Molecule Figure 8-TEMED Molecule Figure 9-Polyacrylamide Matrix 第三次实验第三次实验4.制备浓缩胶：0.5 M Tris-HCl(pH 6.8)5.0 ml 0.1 M EDTA 0.2 ml 丙烯酰胺溶液

17、（单体）2.0 ml 双蒸水 12.4 ml混匀，加入3%过硫酸铵0.4 ml，TEMED 20 l后迅速混匀，立即倒入玻璃板中间，插入梳子（不得有气泡），然后不断补充梳齿空间，直至彻底凝固。2010年：年：0.8 ml+40 l5.加样：浓缩胶凝固后，固定好玻璃板，垂直向上拔出梳子，整理加样槽。加入电泳液并使液面高过齿面。取加样缓冲液10 l，样品RNA 10 l，在憎水膜上混匀，加入一个齿孔中，不要漏入两旁的齿孔，不要产生气泡。如此操作，加入所有样品。6.电泳：正确接好电线正、负极，单片胶1820 mA,稳流条件16小时，双片胶约40 mA,稳流条件16小时。溴酚蓝移动至底边1 cm可终止

18、电泳。Figure 12-Bromophenol Blue Molecule 第四次实验第四次实验c)显影与定影 电泳断电后，取下玻璃板，轻轻撬开玻璃板，将玻璃板与凝胶分离，在凝胶左下角切一小口作记号1.显影：将凝胶放入AgNO3显影液，振荡1 h,倒掉液体，单蒸水洗34遍，加入显影增强液，甲醛2ml，振荡1020 min，待条带清晰出现，单蒸水洗34遍。2.定影：将凝胶放入终止固定液中，观察结果，拍照。End SDS(Sodium dodecylsulfate)is a detergent(Figure 4)that binds to proteins to give them an ove

19、rall negative charge,allowing proteins to migrate in one direction only.Thus,they can be easily separated according to size.Figure 4-SDS Molecule Figure 11-Beta-Mercaptoethanol(B-ME)Molecule Figure 13-Movement of ProteinsELISA ELISA是一种免疫测定法。免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术检测样本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗

20、体或抗原性物质。ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免

21、疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。木瓜酶裂解部位 胃蛋白酶裂解部位 免疫技术常用的酶及其底物底显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492*460*449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405,420-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420 *终止剂为2mol/L H2SO4 *终止剂为2

22、 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达。ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及

23、检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：1双抗体夹心法测抗原 双抗原夹心法测抗体 间接法测抗体 竞争法测抗体 竞争法测抗原 快速一步法检测轮状病毒抗原快速一步法检测轮状病毒抗原 本试剂由A群轮状病毒单克隆抗体制成，在室温条件下15分钟判定结果。具有快速、特异、方法简单可分多次使用、结果准确等优点，是快速诊断，及时指导治疗轮状病毒性腹泻的有力工具。本品适用于各级医院诊断，同时适用于猪、牛、马、羊、家免、鸡、鸭等畜牧场的幼畜急性腹泻粪样轮状病毒病原的检测。试剂盒组成 1轮状病毒抗体包被的反应孔，12孔4条。2取粪样塑料管50支。3酶结合物试剂l瓶。4阳性对照1支。5洗涤液1支。6显色剂A一瓶。7显色剂B一瓶。操作方法1用取样塑料管直接吸取待检粪样1滴(大约50微升)，滴于反应孔内。2立即滴加酶结合物1滴(50微升)，轻拍混匀。3室温下静置10分钟，甩去，加洗涤液1滴，用自来水冲洗10次以上，甩尽拍干。4每孔加入显色剂A、B各一滴，置室温5分钟判定结果。结果判定 肉眼观察显兰色判为阳性“”，不显色判为阴性“”。End