教培用遗传病基因诊断学年课件.ppt

1、遗传病基因诊断学年主主 要要 内内 容容一、基因诊断概念一、基因诊断概念二、基因诊断基本原理及常用技术二、基因诊断基本原理及常用技术 1、核酸分子杂交、核酸分子杂交 2、探针标记、探针标记 3、PCR技术技术 4、DNA测序测序 5、DNA微阵列（微阵列（DNA芯片）芯片）三、基因诊断方法三、基因诊断方法四、基因诊断四、基因诊断-遗传病产前诊断遗传病产前诊断一、基因诊断概念一、基因诊断概念传统诊断法传统诊断法:表现型表现型 推测推测 基因型。基因型。基因诊断法基因诊断法:基因型基因型 推知推知 表现型。表现型。检测核酸检测核酸 分析分析 特定基因特定基因 判断判断 基因型。基因型。基因诊断特征

2、基因诊断特征:1.检测检测DNA不受被检测来源的限制。不受被检测来源的限制。2.症状前诊断成为可能。症状前诊断成为可能。3.对遗传病可进行分子水平再分类对遗传病可进行分子水平再分类-遗传异质性遗传异质性的分子水平阐明。的分子水平阐明。二、基因诊断基本原理及常用技术二、基因诊断基本原理及常用技术1、核酸分子杂交、核酸分子杂交 双链双链DNA 变性变性 单链单链 复性复性 杂种杂种DNA 加热加热,强酸强酸,探针探针 强碱强碱,变性剂变性剂 探针探针:一段与待测一段与待测DNA或或RNA互补的核苷酸序列互补的核苷酸序列,作为作为工作状态的探针必须是单链工作状态的探针必须是单链。常用探针种类常用探针

3、种类:基因组基因组DNA,cDNA,人工合成的寡人工合成的寡核苷酸。核苷酸。制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针核酸分子杂交操作程序核酸分子杂交操作程序（1）斑点杂交）斑点杂交（Dot blotting hybridization）主要用于基因缺失和拷贝数改变。主要用于基因缺失和拷贝数改变。应用：应用：1）混合样品）混合样品DNA鉴定鉴定2）基因缺失检测）基因缺失

4、检测3）基因表达分析）基因表达分析 ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）探针（等位基因特异性寡核苷酸）-检测已知点突变。检测已知点突变。磁激活细胞分选法(MACS)；PAH基因于1983年定位于12q24，全长85kb，含13个外显子，mRNA全长，编码451个氨基酸。（1）PCR-RFLP长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。其中最主要的是产前基因诊断：S CCTGTGG 应用FISH、PCR等技术分析特异基因。加热,强酸,探针产物2、FVIII基因intron 18中的Bcl I/RFLP；1 1 2 22、荧光原位杂交（FISH）方法；应用FISH、

5、PCR等技术分析特异基因。4:检出 外显子19的先证者和胎儿；第1组为外显子19、43、45、34 引物富集和分离胎儿有核红细胞法:症状前诊断成为可能。探针:一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列,作为工作状态的探针必须是单链。四、基因诊断-遗传病产前诊断 1975年年Southern建立的检测建立的检测DNA技术。技术。基因组基因组DNA 限制酶消化限制酶消化 凝胶电泳分离凝胶电泳分离 变性变性 转移到转移到 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜(尼龙膜尼龙膜)固定固定 预杂交预杂交 探针探针 杂杂交交 洗膜洗膜 放射自显影放射自显影 分析杂交片段的大分析杂交片段的大小及密度。小及密度。可检测可检测:

6、DNA片段的缺失片段的缺失,插入插入,重排等。重排等。改变限制酶酶切位点的点突变。改变限制酶酶切位点的点突变。DNA扩增等拷贝数改变。扩增等拷贝数改变。RFLP等多态性。等多态性。（2）Southern印迹杂交印迹杂交 检测检测RNA的分子杂交技术的分子杂交技术 提取组织总提取组织总RNA oligodT mRNA 含甲醛的含甲醛的 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离 转移转移 预杂交预杂交 探针探针 杂交杂交 洗膜洗膜 放射自显影。放射自显影。检测特异检测特异mRNA大小和表达量。大小和表达量。（3）Northern 印迹杂交印迹杂交 染色体标本上，组织切片上分子杂交染色体标本上，组织切片

7、上分子杂交 原位杂交原位杂交-3H标记探针标记探针 FISH-荧光素或生物素标记荧光素或生物素标记 应用于基因定位，染色体数目及结构异常应用于基因定位，染色体数目及结构异常诊断。诊断。组织切片上的组织切片上的FISH-mRNA水平表达及一水平表达及一些病原体感染诊断。些病原体感染诊断。（4）原位杂交及荧光原位杂交）原位杂交及荧光原位杂交（Flurescence in situ hybridization，FISH）肌球蛋白肌球蛋白mRNA在在胚胎小鼠心脏原位表达胚胎小鼠心脏原位表达荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染）与染色体涂染 1985年年 cetus公司的公司的Kary M

8、ullis创建，创建，80年代一向革命性技术，年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔年获诺贝尔化学奖。化学奖。模拟生物体内的模拟生物体内的DNA复制，在体外复制，在体外DNA聚聚合酶酶促合成某一特异合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。片断的技术。3、PCR技术技术（Polymerase chain reaction)步骤：步骤：变性变性 20-30周期周期 复性复性 延伸延伸 引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长度度。该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，目前自动化操作。目前自动化操作。PCR扩增扩

9、增（1）PCR-RFLP PCR扩增后酶切，检测点突变或多态。扩增后酶切，检测点突变或多态。（2）PCR-SSCP 单链构象多态（单链构象多态（single strand conformation polymorphism,SSCP）：）：DNA单链在非变性胶单链在非变性胶中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。长度相同，但只要一个碱基的差别长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同形成不同构象构象 泳动速率不同泳动速率不同 形成不同泳动带。形成不同泳动带。能检测已知和未知点突变。能检测已知和未知点突变。-primer -32P-dNTP掺入掺入 P

10、CR扩增扩增 产物产物 变性变性 单链单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影自显影 1.为正常为正常 结果分析结果分析 2、4、5纯合患者纯合患者 3.为杂合子为杂合子 (3)PCR-DGGE 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）Tm值值-DNA双链双链50%解链温度。解链温度。Tm值主要与碱基组成相关。值主要与碱基组成相关。PCR扩增后的扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙，在变性梯度由低到高的聚丙烯酰氨凝胶电泳过程中，烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的值

11、低的DNA片段先片段先解链，电泳速度变慢解链，电泳速度变慢 一个碱基差异也能改变一个碱基差异也能改变Tm值导致泳动速率改变值导致泳动速率改变 产生泳动变位，产生泳动变位，能检能检测已知，未知点突变。测已知，未知点突变。检测突变率比检测突变率比PCR-SSCP高。高。4、DNA测序测序 Sanger法法-双脱氧核苷酸末端终止法。双脱氧核苷酸末端终止法。双脱氧核苷酸不能形成双脱氧核苷酸不能形成5磷酸和磷酸和3OH之间的之间的磷酸二脂键（因磷酸二脂键（因3也脱氧）而终止反应。也脱氧）而终止反应。4个反应体系分别加入个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在，

12、将产生不同长度（在A，G，C，T处随处随机终止）的机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是呈梯状带型，自下而上是5 3被合成的被合成的DNA链顺序。链顺序。DNA自动测序自动测序 应用如上原理，不同的是：应用如上原理，不同的是：4种不同荧光染料标记的种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反掺入酶促反应应(不用分不用分4个反应体系个反应体系)。经过毛细管凝胶电泳分离经过毛细管凝胶电泳分离(不用分不用分4个泳道个泳道)。激光分析和计算机处理，直接标出碱基序激光分析和计算机处理，直接标出碱基序列。列。焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序检测结肠癌焦磷酸测

13、序检测结肠癌KRAS基因突变基因突变下一代下一代“克隆克隆”测测序序5、DNA微阵列（微阵列（DNA芯片）芯片）在杂交测序基础上发展起来的：在杂交测序基础上发展起来的：大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针有规律地排列在指甲大小的芯片上有规律地排列在指甲大小的芯片上-制作寡核制作寡核苷酸阵列。苷酸阵列。将待测的将待测的DNA，RNA或或cDNA用荧光标记后在用荧光标记后在DNA芯片上与探针杂交。芯片上与探针杂交。用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算机处理荧光信号，得出所需信息。机处理荧光信号，得出所需

14、信息。High-resolution melt curve analysis(HRM)Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization(CGH)三、基因诊断方法三、基因诊断方法1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。能作直接诊断的条件：能作直接诊断的条件：遗传方式已知遗传方式已知 病因基因或病因基因或cDNA已克隆分离已克隆分离 突变性质与疾病关系已阐明突变性质与疾病关系已阐明 基因突变类型：基因突变类型：1、DNA碱基置换碱基置换(点突变点突变

15、)2、DNA片段的缺失、插入、重复等片段的缺失、插入、重复等 3、动态突变、动态突变检测点突变检测点突变 已知点突变检测：已知点突变检测：1、RFLP 2、ASO探针杂交法探针杂交法 3、等位特异性、等位特异性PCR 4、PCR-SSCP5、PCR-DGGE 未知点突变检测：未知点突变检测：1、PCR-SSCP2、PCR-DGGE3、DNA测序测序4、DHPLC（1）RFLP方法方法-检测已知突变检测已知突变 基因较大片段缺失或插入基因较大片段缺失或插入 酶切片段长度改变。酶切片段长度改变。基因点突变正好发生在某限制酶识别位点基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 酶酶切点消失或增加切点消失或增

16、加 酶切片段长度改变。酶切片段长度改变。酶切图谱法检测的缺点酶切图谱法检测的缺点:不直接影响酶切点的突变不能检测到。不直接影响酶切点的突变不能检测到。产生的片段大小太相似也不易被检测到。产生的片段大小太相似也不易被检测到。特异性扩增含酶切位点的特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶扩增片段，再经酶切后电泳检测切后电泳检测-更简便更简便,快速快速,也能弥补缺点。也能弥补缺点。镰状细胞血红蛋白（镰状细胞血红蛋白（HbS）56 bp 54 bp A CCTGAGG 110 bp S CCTGTGG Mst II PCR（2）ASO探针杂交法探针杂交法-检测已知点突变检测已知点突变 等位特异性寡

17、核苷酸探针（等位特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide probe，ASO）以点突变为中心）以点突变为中心合成合成20bp左右的一对探针：左右的一对探针：与正常序列杂交的探针与正常序列杂交的探针 与异常序列杂交的探针与异常序列杂交的探针 优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变也能检测。也能检测。缺点缺点:突变位点及性质清楚的前提下才能合成突变位点及性质清楚的前提下才能合成ASO探针，只能检测已知点突变。探针，只能检测已知点突变。2、间接方法、间接方法-连锁分析法连锁分析法 基因内或基因近旁基因内或基因近旁

18、DNA多态为遗传标记进行连锁多态为遗传标记进行连锁分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色体而作出诊断。体而作出诊断。DNA多态性（多态性（DNA polymorphism）：群体当中）：群体当中不同染色体上的基因每几百个不同染色体上的基因每几百个bp中大约有中大约有1个的个的比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变异的频率在群体中占异的频率在群体中占1%以上，这种现象叫以上，这种现象叫DNA多态性。多态性。这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。第一代遗传标记：限制性片段长

19、度多态性（第一代遗传标记：限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）第二代遗传标记：数目可变的串联重复第二代遗传标记：数目可变的串联重复（Variable number tandem repeat，VNTR）大约几十大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝长的碱基序列在人群中其重复的拷贝数不同所产生的多态，一般在非编码区中。数不同所产生的多态，一般在非编码区中。小卫星小卫星DNA(628bp)n 微卫星微卫星DNA(26bp)n，也称，也称STRP（small tandem repeat polymorphism）例如

20、例如:FVIII基因基因 ST14(DXS52)位点位点(60bp)n DMD基因基因intron 44、45、49、50中中(CA)n PAH基因基因 intron3中中STR(4bp)n 优点优点:群体中等位基因数目多，杂合子频率高。群体中等位基因数目多，杂合子频率高。第三代遗传标记：单核苷酸多态第三代遗传标记：单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism，SNP）基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百1kb之中有一个。之中有一个。应用于：应用于：疾病的关联分析疾病的关联分析基因功能鉴定基因功能鉴定基因发现和制图基因发现和制图

21、候选基因发现候选基因发现连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例连锁分析举例4.07.0II 34.07.04.07.0I 24.29.7II 14.07.04.27.0I 14.27.04.07.0II 24.29.74.07.0连锁分析举例连锁分析举例连锁分析的优点连锁分析的优点 不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内或近旁或近旁DNA多态标记就可以分析。多态标记就可以分析。缺点缺点:1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的、必须要有先证者以及家系中相关各成员的DNA才能分析。才能分析。2、携带者是杂合子时才能分析。、携带者

22、是杂合子时才能分析。3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源染色体交叉互换导致误诊的可能性。染色体交叉互换导致误诊的可能性。四、基因诊断四、基因诊断-遗传病产前诊断遗传病产前诊断1、甲型血友病（、甲型血友病（Hemophilia A）：）：FVIII因子遗传因子遗传性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病.发病率：男性的发病率：男性的1/50001/10000，XR。症状症状:自然或轻微外伤后出血不止。自然或轻微外伤后出血不止。皮下、关节、肌肉出血皮下、关节、肌肉出血-关节强直、劳动力丧关节强直、劳动力丧失。失。颅内出血可危及生

23、命。颅内出血可危及生命。根据血浆中根据血浆中F浓度可分为轻、中、重度。浓度可分为轻、中、重度。诊断、治疗诊断、治疗 血浆代用品血浆代用品 分离的分离的F因子因子 基因工程产品基因工程产品FVIII因子因子 基因治疗基因治疗 FVIII基因于基因于1984年克隆并定位于年克隆并定位于Xq28，全长，全长186kb，含，含26个外显子，个外显子，25个内含子，个内含子，mRNA全全长为长为9kb，编码，编码2351个氨基酸。个氨基酸。由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不集中集中-直接诊断受限制。直接诊断受限制。间接基因诊断间接基因诊断 方案：先检测方

24、案：先检测SRY，ZFY/ZFX基因，诊断性别后基因，诊断性别后 间接诊断间接诊断连锁分析连锁分析1、首先、首先ST14（DXS52）位点的）位点的VNTR多态；多态；2、FVIII基因基因intron 18中的中的Bcl I/RFLP；3、FVIII基因基因intron 22中的中的Xba I/RFLP；4、FVIII基因基因intron 13中的（中的（CA）n多态。多态。直接诊断：检测直接诊断：检测i22的倒位。的倒位。长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在A，G，

25、C，T处随机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是5 3被合成的DNA链顺序。复性 延伸结果分析 2、4、5纯合患者 1.分离母体外周血中的胎儿细胞小卫星DNA(628bp)n 产生的片段大小太相似也不易被检测到。BMD比DMD发病晚，病情轻。不直接影响酶切点的突变不能检测到。FVIII基因 ST14(DXS52)位点(60bp)n基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 酶切点消失或增加 酶切片段长度改变。PAH基因于1983年定位于12q24，全长85kb，含13个外显子，mRNA全长，编码451个氨基酸。富集和分离胎儿有核红细胞法:荧光原位杂交（FISH）与染色体涂

26、染2、假肥大型肌营养不良症、假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)肌萎缩中占肌萎缩中占60%。由于抗肌萎缩蛋白（由于抗肌萎缩蛋白（dystrophin）遗传性缺陷所）遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。发病率为发病率为1/3500，XR遗传。遗传。BMD比比DMD发病晚，病情轻。发病晚，病情轻。主要症状：通常主要症状：通常3-5岁发病，开始走路不稳，鸭岁发病，开始走路不稳，鸭型步态，上楼梯困难，型步态，上楼梯困难，Gower征阳性，进行性肌征阳性，进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大，萎缩伴有腓肠肌假性肥大，10多岁下肢瘫，一般多岁下肢瘫，

27、一般在在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。）升高。肌电图：肌源性改变等。肌电图：肌源性改变等。1987年年Kunkel等克隆等克隆DMD基因，定位于基因，定位于Xp21，全长全长2400kb，含，含79个外显子，个外显子，cDNA长度为长度为14kb。目前已知目前已知DMD的的50%80%是由于是由于DMD基因不同基因不同区段的缺失，缺失发生热点区位于区段的缺失，缺失发生热点区位于DMD基因基因5端端（219）以及外显子）以及外显子4452。直接基因诊断：直接基因诊断：应用多重应用多重PCR（m

28、ultiplex PCR）检测缺失，）检测缺失，12对引物（对引物（4 3），能检测），能检测98%缺失。缺失。多重链接依赖探针扩增（多重链接依赖探针扩增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）间接诊断间接诊断:RFLP连锁分析连锁分析（CA）n连锁分析：连锁分析：DMD基因基因5 端和端和3 端，端，内含内含44、45、49、50中的（中的（CA）n多态，进多态，进行单体型连锁分析。行单体型连锁分析。多重多重PCR检测缺失检测缺失 Duchenne/Becker型肌营养不良型肌营养不良(DMD/BMD)方法：根据方法：根据

29、DMD基因缺失的分布设计基因缺失的分布设计12对引物，对引物，分成分成3组：组：第第1组为外显子组为外显子19、43、45、34 引物引物 第第2组为外显子组为外显子51、12、50、53 引物引物 第第3组为外显子组为外显子48、17、8、52 引物引物 分别对患者基因组分别对患者基因组DNA进行扩增，每次扩增均同进行扩增，每次扩增均同时设空白和正常对照。时设空白和正常对照。1:DL2000marker；2:正常对照正常对照(第第1组引物组引物)；3.4:检出检出 外外显子显子19的先证者和胎儿；的先证者和胎儿；5:正常对照正常对照(第第2组引物组引物)；6.7:检检出出 外显子外显子51的

30、先证者和胎儿；的先证者和胎儿；8:正常对照正常对照(第第3组引物组引物)；9.10:检出检出 外显子外显子48的先证者和胎儿。的先证者和胎儿。3、苯丙酮尿症（、苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）由于苯丙氨酸羟化酶（由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalanin hydroxyrase，PAH）遗传性缺陷所致的遗传性）遗传性缺陷所致的遗传性氨基酸代谢病氨基酸代谢病 发病率为发病率为1/16500，AR遗传。遗传。临床表现：临床表现：智力低下智力低下 黑色素形成障碍黑色素形成障碍 尿有特殊氨味尿有特殊氨味诊断、治疗诊断、治疗 PAH基因于基因于1983年定位于年定位于12q24，全

31、长，全长85kb，含，含13个外显子，个外显子，mRNA全长，编码全长，编码451个氨基酸。个氨基酸。PAH基因缺陷基因缺陷-以点突变为主，且以点突变为主，且1/3点突变集点突变集中于外显子中于外显子7，另外外显子，另外外显子6，11，12也较集中。也较集中。PKU基因诊断策略基因诊断策略:1、应用内含子、应用内含子3的的STR多态进行连锁分析。多态进行连锁分析。2、应用、应用PCRSSCP，PCRDGGE技术检测外显技术检测外显子第子第7、6、11、12的点突变。的点突变。6%DGGE检测家系成员检测家系成员PAH基因外显子基因外显子6的电泳图的电泳图：1 1 2 2121N？4、先天愚型（

32、、先天愚型（Down综合征）综合征）最常见的常染色体病，发病率为最常见的常染色体病，发病率为1/7001/800，主要是主要是21三体所致（约三体所致（约5%是易位型和嵌合型）。是易位型和嵌合型）。临床特征：先天性智力低下、特殊面容、体格发临床特征：先天性智力低下、特殊面容、体格发育迟缓、伴先天畸型，特征性皮肤纹理等。育迟缓、伴先天畸型，特征性皮肤纹理等。基因诊断：基因诊断：1、应用、应用D21S11为遗传标记的定量为遗传标记的定量PCR；2、荧光原位杂交（、荧光原位杂交（FISH）方法；）方法；3、荧光定量、荧光定量PCR（QF-PCR）。）。荧光定量荧光定量PCR方法检测方法检测21-三体

33、三体五、产前基因诊断进展五、产前基因诊断进展 遗传病基因诊断主要应用遗传病基因诊断主要应用:1、产前基因诊断、产前基因诊断-终止妊娠；终止妊娠；2、携带者基因诊断、携带者基因诊断-指导婚姻、生育；指导婚姻、生育；3、症状前诊断、症状前诊断-如如HD，SCA等。等。其中最主要的是产前基因诊断：其中最主要的是产前基因诊断：孕孕7-8周绒毛周绒毛 孕孕16-20周羊水周羊水 无创性无创性-新进展新进展绒毛膜绒毛取样（绒毛膜绒毛取样（CVS）羊水穿刺羊水穿刺植入前诊断（植入前诊断（Preimplantation genetic diagnosis，PGD）受精卵卵裂受精卵卵裂68个细胞期显微操作获取：

34、个细胞期显微操作获取：单个胚胎细胞单个胚胎细胞 未受精极体未受精极体 再应用再应用PCR、FISH等技术分析特异基因或染色等技术分析特异基因或染色体畸变。体畸变。正常正常-植入植入 异常异常-遗传缺陷控制在最早阶段遗传缺陷控制在最早阶段 已有报道：胎儿性别、囊性纤维化、甲型血友病已有报道：胎儿性别、囊性纤维化、甲型血友病、HbS、染色体异常等的植入前诊断。、染色体异常等的植入前诊断。分离母体外周血中的胎儿细胞分离母体外周血中的胎儿细胞 母体外周血中可用于产前诊断的细胞类型：合体母体外周血中可用于产前诊断的细胞类型：合体滋养细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞、胎儿有滋养细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞

35、、胎儿有核红细胞（核红细胞（NRBC）。）。NRBC-有形态学特征：有形态学特征：胎儿有核红细胞单克隆抗体（如胎儿有核红细胞单克隆抗体（如CD71、CD36、GPA等）等）胎儿血红蛋白单克隆抗体（抗胎儿血红蛋白单克隆抗体（抗-和抗和抗-）富集和分离胎儿有核红细胞法富集和分离胎儿有核红细胞法:密度梯度离心法；密度梯度离心法；荧光激活细胞分选法荧光激活细胞分选法(FACS)；磁激活细胞分选法磁激活细胞分选法(MACS)；免疫磁珠法；免疫磁珠法；显微操作分选法。显微操作分选法。引物延伸预扩增引物延伸预扩增（primer-extension preamplication，PEP）扩增单个）扩增单个NR

36、BC DNA。应用多个应用多个STR位点检测确定位点检测确定NRBC的胎儿源性。的胎儿源性。应用应用FISH、PCR等技术分析特异基因。等技术分析特异基因。分离孕妇血浆中的胎儿分离孕妇血浆中的胎儿DNA 1997年年Lo 等报道孕妇血浆或血清中存在胎儿游等报道孕妇血浆或血清中存在胎儿游离离DNA，可作为产前诊断材料。，可作为产前诊断材料。可能的机制为可能的机制为:1、胎儿细胞经胎盘进入母血，被母血免疫系统、胎儿细胞经胎盘进入母血，被母血免疫系统破坏，将破坏，将DNA留在血浆中。留在血浆中。2、胎盘在胎母界面不断塑形，细胞被溶解，将、胎盘在胎母界面不断塑形，细胞被溶解，将DNA释放入母体循环。释放入母体循环。