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1、酶类药物医学知识酶类药物医学知识 主要内容主要内容：一、概述 二、酶类药物的分类 三、酶类药物的制备 几种重要酶类药物的制备工艺 知识目标：知识目标：掌握酶类药物分类、应用和生产方法 掌握SOD的生产工艺 了解酶类药物的发展趋势酶类药物医学知识2一、概述一、概述 1、酶(enzyme)的特点 酶具有高度专一性和催化效率.酶催化反应的反应条件温和.酶的催化活性在生物体内受到多种因素的调节.酶对底物的结构具有严格的选择性.2、药用酶是用于预防、治疗、诊断疾病的一类酶制剂。酶类药物医学知识33、酶类药物的发展历程 l4千多年前的夏禹时代就盛行酿酒；周朝已开始制醋、酱、豆豉（在霉菌蛋白酶作用下产生的风

2、味食品）和饴糖（主要含麦芽糖）.l1833年，Payen从麦芽的抽提物中沉淀出一种对热不稳定的物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖，人们开始意识到生物细胞中可能存在着一种类似催化剂的物质.l1893年 francs用木瓜蛋白酶治疗白喉和结核性溃疡病，疗效较好.l1896年，WKuhne首先把这类物质称为“enzyme”，中文译为“酶”.l1897年Buchner成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞.l1926年Sumner首次提取出脲酶，并进行结晶。l20世纪60年代中期以前，一般动植物来源的酶已陆续投入生产，随后，又向着生产各种微生物来源的酶和辅酶

3、的方向发展。现已有二千余种酶被鉴定出来，已经应用的有1211多种其中有二百余种得到结晶。酶类药物医学知识4二、酶类药物的分类二、酶类药物的分类1.1.消化酶类 胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，用于治疗消化不良、食欲不振、急慢性肠胃炎、消化功能受阻等。2.2.消炎（抗炎）l胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于消炎、消肿、清疮、排脓和促进伤口愈合；l胶原蛋白酶用于治疗褥疮和溃疡；l溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、水痘、带状疱疹和扁平疣等 l木瓜凝乳蛋白酶用于治疗椎间盘突出症；l胰蛋白酶还用于治疗毒

4、蛇咬伤。依照其功效和临床应用分类依照其功效和临床应用分类酶类药物医学知识53心血管疾病治疗l弹性蛋白酶能降低血脂，用于防治动脉粥样硬化；l激肽释放酶有扩张血管、降低血压作用；l某些酶制剂对溶解血栓有独特效果。如尿激酶、链激酶、蚓激酶、纤溶酶及蛇毒溶栓酶。l凝血酶可用于止血。4.4.抗肿瘤酶类生化产品l用于治疗某些肿瘤，如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶等。lL-门冬酰胺酶是一种抗白血病药物，它是利用门冬酰胺酶选择性地争夺某些类型瘤组织的营养成分，干扰或破坏肿瘤组织代谢，而正常细胞能自身合成门冬酰胺故不受影响。l谷氨酰胺酶能治疗多种白血病、腹水瘤、实体瘤等。l神经氨酸苷酶是一种良好的肿瘤免疫治疗

5、剂。l尿激酶可用于加强抗癌药物如丝裂霉素(mitomycin)的药效，l米曲溶栓酶也能治疗白血病和肿瘤等酶类药物医学知识65、其他酶类生化产品l细胞色素c是参与生物氧化的一种非常有效的电子传递体，是组织缺氧治疗的急救和辅助用药；l超氧化物歧化酶(SOD)用于治疗类风湿性关节炎、放射病，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面也有显著疗效。lPEG-腺苷脱氢酶用于治疗严重的联合免疫缺陷症；lDNA酶和RNA酶可降低痰液黏度，用于治疗慢性气管炎；l透明质酸酶用于药物扩散剂；l青霉素酶可治疗青霉素过敏。酶类药物医学知识76辅酶类生化产品 辅酶或辅基在酶促反应中起着递氢、递电子或基团转移作用，对酶的催化作用的化学

6、反应方式起着关键性决定作用。多种酶的辅酶或辅基成分具有医疗价值。如烟酰胺腺、腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(NADP)、黄素单核苷酸(FMN)、泛醌、辅酶A等已广泛用于肝病和冠心病的治疗。辅酶A常与ATP、细胞色素c、胰岛素等组成复方制剂以增强疗效。酶类药物医学知识8三、酶类药物的制备三、酶类药物的制备1、原料选择（1）不同酶的用料选择(含量低）（2）注意不同生长发育情况及营养状况 （3）原料来源丰富 （4）从简化提纯步骤着手（鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿，减少肝糖原）（5）如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取材。随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐

7、渐转向微生物。酶类药物医学知识92、微生物酶制剂高产菌株的选育l自然界分离筛选.l物理、化学方法处理、诱变.l基因重组与细胞融合技术.3、微生物酶制剂生产发酵技术l菌株产酶的最适培养条件（培养基、温度、PH、通气量）l一系列工艺条件（灭菌方式、发酵罐型号）酶类药物医学知识10（1 1）材料的预处理）材料的预处理 动物材料的预处理动物材料的预处理：l 机械法l 冻融l 丙酮粉 微生物材料的预处理微生物材料的预处理:l 干燥法：干燥后菌体产生自溶。空气干燥法：适合于酵母，热稳定性好的酶。真空干燥法：适合细菌 冷冻干燥：适合于较敏感的酶。l 机械法l 酶法处理4、酶类药物的提取与纯化、酶类药物的提取

8、与纯化酶类药物医学知识11（2）酶的提取酶的提取l水溶解法：常用稀盐溶液或缓冲液提取，一般在低温下操作，酸性蛋白酶用碱性溶液提取，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，盐溶度以等渗为好，0.15mol/L NaCl的离子强度是最适合酶的提取。l有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂类牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合的脂类，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。l表面活性剂法 表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故可以提取结合酶。酶类药物医学知识12（3 3）酶制剂的工业提取法）酶制剂的工业提取法l发酵液的预处理及过滤：在发酵液中加入絮凝剂（聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸）

9、l酶液的脱色（活性炭、脱色树脂）l 盐析l 有机溶剂法l 喷雾干燥直接制备粉末酶制剂酶类药物医学知识13（4 4）酶的纯化）酶的纯化 凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化.注意两个问题：1.1.建立快速的测定酶活力的方法 2.2.建立活力回收表 酶类药物医学知识14杂质去除l PH和加热沉淀法l 蛋白质表面变性法l 选择性变形法l 核酸沉淀剂法l 酶与底物结合 脱盐(透析、凝胶过滤）浓缩（超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和聚乙二醇浓缩）酶的结晶-处于过饱和状态l 盐析法l 有机溶剂沉淀法l 复合结晶法l 透析平衡法l 等电点法酶分离和纯化过程的注意事项-（变性、辅因子的流失、降解）酶类

10、药物医学知识15 l1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶l1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。l超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种：（1）是Cu.ZnSOD，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；（2）是MnSOD，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体 和原核细胞内；（3）是FeSOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。1、概述 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase,SOD）酶类药物医学知识16人类SOD酶的晶体结构

11、（彩虹彩色图：N-末端末端=蓝色，C-末端末端=红色）结合铜（蓝-绿球）与锌（灰球）线粒体SOD酶类药物医学知识172 2、SODSOD临床作用 酶类药物医学知识183 3、SODSOD的应用领域的应用领域 （1 1）药物类）药物类主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；（2 2）生化制药）生化制药 作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统；（3 3）化妆品）化妆品 可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以SOD为主要成份的化妆品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使

12、人类永葆青春美丽梦想成真；（4 4）保健食品、饮料）保健食品、饮料 SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销。在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统。酶类药物医学知识19酶类药物医学知识204 4、SODSOD的性质的性质l对热稳定：天然牛血SODSOD可7575加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关l对pHpH的稳定性：一般pH5.39.5pH5.39.5较稳定，猪血SODSOD在pH7.6pH7.69 9较稳定l金属辅基与酶活性关系 Cu Cu、Zn-SODZn-SOD：ZnZn与分子结构有关，与催化活性无关 Cu Cu与活性有关，

13、对酶活力是必需的 Mn-SOD Mn-SOD：MnMn对酶活力是必需的 Fe-SOD Fe-SOD：FeFe对酶活力是必需的酶类药物医学知识21提取工艺要点：提取工艺要点：l溶血液制备：新鲜牛血以3.8%柠檬酸钠抗凝,血球分离机分离红细胞,加2倍无离子水,搅拌溶血30 min.l选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜,搅拌、蒸汽加热至68,加入适量蛋白质沉淀剂使血红 蛋白完全变性后,将反应液泵入冷却罐,搅拌机搅拌,迅速冷却至15,按反应液总体积补加适量蛋白质沉淀剂,搅拌1 h,甩干过滤去除变性血红蛋白,过滤液3000rpm 20min低速离心,去除颗粒沉淀物.l超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗

14、粒,经超滤器超滤浓缩至总体积的1/200,收集浓缩液.l丙酮沉淀：超滤浓缩液预冷至4,加入等体积预冷的工业丙酮,放置1h,4000rpm 30min冷冻离心,沉淀用少量无离子水回溶,对无离子水透析12h,4000rpm 30min冷冻离心,收集上清液.l柱层析：经处理的DEAE-52装柱,用2.5mM/L 缓冲液平衡,缓慢上样,用梯度洗脱,收集SOD部分,对无离子水透析12h.l冷冻干燥 透析后的酶液经浓缩,置冻干机内冷冻干燥,升温速率控制在5/h.酶类药物医学知识236 6、SODSOD的检测的检测lSOD酶活力测定 采用邻苯三酚自氧化法,25自氧化速率0.07,pH8.2,50mM Tri

15、s-HCl缓冲液.l 蛋白质浓度测定 采用Lowry法,以250g/ml BSA作标准曲线.l分子量测定 采用SDS-PAGE电泳法,浓缩胶3.5%分离胶10%.l 紫外吸收光谱检测 扫描波长范围230300 nm.酶类药物医学知识24 溶菌酶（溶菌酶（lysozymelysozyme）1、概述 （1）溶菌酶（又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱

16、辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。（2）20世纪初，英国细菌学家弗莱明（Flemin）在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。酶类药物医学知识25（3）性质：l其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚，l溶菌酶由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，l等电点在pH10.8左右，l分子量为14000，l化学性质非常稳定，当PH值在1.2-11.3的范围剧烈变化时，其结构几乎不变，l在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，pH4.0-7时，

17、100 处理1min仍能保持原油酸活性；pH值低于4时，能耐100加热处理，l在空气湿度较低时，溶菌酶可以长期在室温下存放。酶类药物医学知识26 2 2、溶菌酶的制备、溶菌酶的制备酶类药物医学知识27 胰蛋白酶（胰蛋白酶（Trypsin）1、概述l 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。l白色或米黄色结晶性粉末。l溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。l分子量24 000，lpI 10.5，最适pH值7.88.5左右。pH9.0不可逆失活。酶类药物医学知识282、临床应用 能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使

18、脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。酶类药物医学知识293、胰蛋白酶的制备（一）酶类药物医学知识30可溶性固定化胰蛋白酶的制备可溶性固定化胰蛋白酶的制备（二）（二）（1）载体的合成：将2g经过碱处理的壳聚糖,置于40 mL二甲亚砜中,在搅拌下加入2g丁二酸酐,于65反应4-6 h。反应结束后过滤,固相用乙醇浸泡1 h,并将pH调到10左右。过滤后将沉淀物溶于蒸馏水中,用4倍体积的丙酮沉淀,沉淀物再依次

19、用无水乙醇和丙酮洗涤,40真空干燥后得N-琥珀酰壳聚糖。称取1g N-琥珀酰壳聚糖,溶于20 mL磷酸盐缓冲液中,调节pH至45左右,离心收集沉淀。将沉淀溶解于20 mL磷酸盐缓冲液,即得载体溶液。（2）可溶性固定化酶(soluble-immobilizedtrypsin,SIT)的制备 在磁力搅拌下向20 mL载体溶液中滴加入一定量的5%EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚溶液和10 mL胰蛋白酶磷酸盐溶液(2 mg/mL),于5-15反应一段时间后,调节溶液pH至45左右,离心收集沉淀,用柠檬酸钠缓冲液(02 mol/L,pH45)洗涤后,离心收集沉淀。沉淀溶于磷酸盐缓冲液(

20、02 mol/L,pH80),定容至50 mL即得SIT溶液。酶类药物医学知识31 尿激酶（尿激酶（Urokinase）1、概述l从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。l本品直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子和凝血因子等，从而发挥溶栓作用l分子式：C21H25BrN2O3l分子量：433.35l本品为白色状粉末。酶类药物医学知识322、临床作用：用于急性心肌梗塞、急性脑血栓形成和脑血管栓塞、肢体周围动静脉血栓、中央视网膜动静脉血栓及其它新鲜血栓闭塞性疾病。酶类药物医学知识333、重组

21、人尿激酶原（、重组人尿激酶原（prouk）的工业化制备）的工业化制备（1）重组人prouk工程菌的发酵 从LB(含50g/mL Kan)平板上挑取prouk工程菌单菌落于500 mL LB培养基中,经37、180 r/min培养约12 h后,接种至10 L种子罐,初始时设定温度为37,pH 7.0,搅拌速度200 r/min,通气量5 L/min,溶氧100%,打开酸泵(2 mol/LHCl)和碱泵(浓氨水)控制pH为7.0.逐渐增加通气量至15 L/min,搅拌速度最终提高到1 000 r/min.发酵进行约4 h,细菌生长进入对数期,OD600可达1215,移入100 L发酵罐.控制pH为

22、7.0,随着发酵的进行,溶氧逐渐下跌,可增加通气量和提高搅拌速度.约3 h后,OD600增至约1215,加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L,开始补充葡萄糖(25%,葡萄糖终浓度为每升低于1.5 g).发酵过程中每1 h取样一次,测定OD600,绘制生长曲线,当生长速度明显减慢,曲线达到基本水平时放罐,用连续流离心机,4、20 000 r/min离心培养物,收集菌体并称量,-80保存备用,整个过程约1012 h.酶类药物医学知识34 （2）重组人prouk的活化 将已知重量的菌体,按8 mL/g湿重比例加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH 7.

23、0)搅拌混匀.用弗氏压碎器破碎细胞两次(16 00018 000 Lb/in2),待细胞裂解液冷至4时用超声匀浆仪超声,直至溶液不再粘稠.4,12 000 g离心30 min.取沉淀物(包涵体)悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液(100 mmol/L Tris,5 mmol/L EDTA,0.5%Triton,2 mol/L Urea,pH 7.0)中,洗涤3次.取洗涤后的湿包涵体约1 000 g溶解于10 L变性缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,6 mol/L盐酸胍,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L DTT,pH 9.0),氮气饱和,45变性12 h.4,8 000 rm

24、in离心30 min,取上清,逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍,NaCl,Urea,GSSG,GSH等的复性缓冲液中,反应终体积为250 L,静置24 h.测定酶活力,参照UK标准曲线定出prouk活力含量.酶类药物医学知识35（3）prouk的分离纯化：将250 L活化液超滤浓缩至50 L,对50 mmol/L HAc-NaAc溶液(pH 4.8)透析.透析液体积每次250 L,每次6 h,连续4次.将透析及过滤后活化液上CM-纤维素柱(直径24 cm),流速约3 L/h,经50 mmol/LHAc-NaAc,0.1 mol/L NaCl,pH4.8缓冲液洗涤后,用50 mmol/LHAc-NaAc,0.5 mmol/L NaCl,pH4.8洗脱液洗脱,收集洗脱峰,超滤浓缩后上Superdex 75柱(60600 mm),每次上样量约1 g,用5 mmol/L HAc-NaAc,0.1 mmol/L NaCl,pH 4.5缓冲液洗脱.（4）去热源：采用Affi-Prep ploymyxin support亲和层析去除内毒素,调prouk样品pH至6.0,并缓慢流过Affi-PrepPolymyxin层析柱,收集穿过液,并对5mmol/L醋酸透析过夜。（5）冷冻干燥酶类药物医学知识36酶类药物医学知识37