中医药干预载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化机制研究课件.ppt

1、 提 纲第一部分重视对动脉粥样硬化泡沫化细重视对动脉粥样硬化泡沫化细胞形成的干预研究胞形成的干预研究背 景泡沫细胞的生物学特征 泡沫细胞是As斑块内特征性病理细胞 是As的早期标志 在形态学上，细胞浆内脂质成分明显增多，在形态学上，细胞浆内脂质成分明显增多，并聚集成滴，镜下可见胞浆呈泡沫样改变；并聚集成滴，镜下可见胞浆呈泡沫样改变；细胞内总胆固醇增加，且胆固醇酯占总胆细胞内总胆固醇增加，且胆固醇酯占总胆固醇的一半以上。固醇的一半以上。两种来源的泡沫细胞As泡沫化细胞单核巨噬细胞泡沫化平滑肌细胞泡沫化As斑块内特征性病理细胞As的早期标志主要产生于主要产生于As损伤的早期损伤的早期是是中后期中后

2、期As病变病变的主要病理细胞成分的主要病理细胞成分炎症介质与泡沫细胞形成抑制泡沫细胞形成是阻止As发生发展的重要途径 大量泡沫细胞堆积形成脂质条纹乃至脂质大量泡沫细胞堆积形成脂质条纹乃至脂质斑块；斑块；斑块的进一步破裂、出血及血栓形成会导斑块的进一步破裂、出血及血栓形成会导致各种心脑血管事件的发生。致各种心脑血管事件的发生。泡沫细胞形成是As发生发展的关键环节。抑制泡沫细胞形成是阻止As发生及进一步发展的重要途经。对泡沫细胞的早期积极干预是防治As及相关心脑血管疾病的重要途径。前期研究的回顾脂欣康干预SD大鼠血管平滑肌细胞泡沫化的研究脂欣康胶囊人参人参皂苷皂苷银杏叶提取物银杏叶提取物三七总皂苷

3、三七总皂苷牛磺酸牛磺酸茶多酚茶多酚功效成分组方中医药功效：益气活血解毒化浊平滑肌细胞的培养与鉴定VSMCVSMC的培养的培养鉴定鉴定VSMCVSMC萌出萌出10 x40 纯化纯化VSMCVSMC10 x40-smooth muscle actin 免疫荧光化学染色免疫荧光化学染色显示肌丝显示肌丝 10 x40ox-LDL诱导细胞泡沫化及鉴定油红油红O O染色观察染色观察VSMCVSMC内脂质内脂质 10 x40 平滑肌细胞平滑肌细胞泡沫化泡沫化平滑肌细胞平滑肌细胞培养培养ox-LDL ox-LDL 培养培养48h48h 油红油红O染色后，镜下可见细胞内有大小不等的脂滴，胞浆呈泡沫样改变，染色后

4、，镜下可见细胞内有大小不等的脂滴，胞浆呈泡沫样改变，高效液相色谱法检测，胆固醇酯占总胆固醇的高效液相色谱法检测，胆固醇酯占总胆固醇的60%以上，以上，表明平滑肌细胞泡沫化成功表明平滑肌细胞泡沫化成功分组及制备含药血清20只200g左右雄性SD大鼠随机分为5组 脂欣康组 血脂康组 洛伐他汀组 罗格列酮组 生理盐水组 灌胃5天取血，制备含药血清研究分组 A 脂欣康组脂欣康组 B 血脂康组血脂康组 C 洛伐他汀洛伐他汀 D 罗格列酮组罗格列酮组 E 生理盐水组生理盐水组 F 空白对照组空白对照组不加含药血清不加含药血清分别加入含药血清分别加入含药血清含药血清干预时间含药血清干预时间4848小时小时

5、对泡沫细胞内总胆固醇含量的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内总胆固醇含量比较各组平滑肌源性泡沫细胞内总胆固醇含量比较高效液相色谱法高效液相色谱法检测胆固醇含量检测胆固醇含量（高效液相色谱法（高效液相色谱法）对泡沫细胞内胆固醇酯含量的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内胆固醇酯含量比较各组平滑肌源性泡沫细胞内胆固醇酯含量比较高效液相色谱法高效液相色谱法检测胆固醇酯含量检测胆固醇酯含量（高效液相色谱法（高效液相色谱法）对总胆固醇与胆固醇酯比值的影响空白对照组空白对照组生理盐水组生理盐水组洛伐他汀组洛伐他汀组罗格列酮组罗格列酮组血脂康组血脂康组脂欣康组脂欣康组总胆固醇与胆固醇酯的比值总胆固醇与胆固醇酯的比值62.

6、75%63.46%47.63%42.25%38.04%37.13%激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度光镜观察空白对照组10 x40生理盐水组10 x40洛伐他汀组10 x40脂欣康组10 x40血脂康组10 x40罗格列酮组10 x40激光共聚焦显微镜观察图像激光共聚焦显微镜观察图像 对细胞内Ca2+浓度的影响 各组平滑肌源性泡沫化细胞内Ca2+浓度的平均荧光强度值 激光共聚焦显微镜检测激光共聚焦显微镜检测泡沫细胞内泡沫细胞内CaCa2+2+浓度浓度（激光共聚焦显微镜）（激光共聚焦显微镜）对VSMC源性泡沫细胞内CD36mRNA表达的影响光镜观察空白对照组10 x40生理盐水组10 x40

7、洛伐他汀组10 x40脂欣康组10 x40血脂康组10 x40罗格列酮组10 x40原位杂交法原位杂交法检测检测B B类清道夫受体类清道夫受体CD36 mRNACD36 mRNA表达表达（原位杂交法）（原位杂交法）对VSMC源性泡沫细胞内CD36mRNA表达的影响各组平滑肌源性泡沫细胞内各组平滑肌源性泡沫细胞内CD36mRNACD36mRNA表达比较表达比较 B B类清道夫受体类清道夫受体白细胞分化抗原白细胞分化抗原3636配体（配体（CD36CD36）（原位杂交法）（原位杂交法）小 结 脂欣康具有与洛伐他汀等相似的显著降低脂欣康具有与洛伐他汀等相似的显著降低总胆固醇及胆固醇酯含量的作用，并且

8、胆总胆固醇及胆固醇酯含量的作用，并且胆固醇酯与总胆固醇的比值均降至固醇酯与总胆固醇的比值均降至50%50%以下；以下；脂欣康具有与洛伐他汀相似的抑制平滑肌脂欣康具有与洛伐他汀相似的抑制平滑肌源性泡沫细胞内源性泡沫细胞内CD36 mRNACD36 mRNA表达的作用，并表达的作用，并且优于洛伐他汀；且优于洛伐他汀；脂欣康可显著降低平滑肌源性泡沫细胞内脂欣康可显著降低平滑肌源性泡沫细胞内的的CaCa2+2+浓度，优于洛伐他汀及血脂康。浓度，优于洛伐他汀及血脂康。小 结脂欣康与血脂康均显著抑制脂欣康与血脂康均显著抑制ox-LDLox-LDL诱导的诱导的VSMCVSMC泡沫化，从而抗泡沫化，从而抗As

9、As斑块形成，并有助斑块形成，并有助于稳定斑块。于稳定斑块。其作用机制：其作用机制：调脂、改善脂质代谢调脂、改善脂质代谢 降低细胞内钙负荷降低细胞内钙负荷 抑制细胞内抑制细胞内CD36 mRNACD36 mRNA的表达的表达 中医药对As泡沫化细胞干预研究其它学者研究工作抗氧化抗氧化调节血脂调节血脂抑制炎症介质抑制炎症介质减少细胞外基减少细胞外基质降解质降解刺梨汁刺梨汁大黄醇提液大黄醇提液甲基莲心碱甲基莲心碱漏芦漏芦马齿苋马齿苋三七总皂苷三七总皂苷扇贝裙边糖胺聚糖扇贝裙边糖胺聚糖小檗碱小檗碱益气活血化痰法等益气活血化痰法等继续挖掘能够干预继续挖掘能够干预AsAs泡沫化细胞的中药并对其作用机制进

10、泡沫化细胞的中药并对其作用机制进行深入研究，对于防治行深入研究，对于防治AsAs具有重要的意义。具有重要的意义。激活过氧化物酶体激活过氧化物酶体增殖物激活受体增殖物激活受体（PPAR）第二部分中医药干预载脂蛋白中医药干预载脂蛋白E E基因基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及其机制研究化及其机制研究 ApoE基因敲除小鼠AS模型ApoEApoE基因敲除小鼠于基因敲除小鼠于19921992年培育成功年培育成功ApoE基因敲除小鼠AS模型20002000年开始，在国内外率先应用年开始，在国内外率先应用ApoEApoE基因敲除小鼠基因敲除小鼠开展心血管病与老年病中西医结合基础研究。

11、开展心血管病与老年病中西医结合基础研究。20022002年开始，发表系列论文。年开始，发表系列论文。20022002年，山东生物医学工程（第年，山东生物医学工程（第4 4期）：载脂蛋白期）：载脂蛋白E E基因敲除小鼠在动基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用；脉粥样硬化研究中的应用；20032003年，中西医结合心脑血管病杂志（第年，中西医结合心脑血管病杂志（第8 8期）：中西药物对载脂蛋白期）：中西药物对载脂蛋白E E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的干预作用；基因敲除小鼠动脉粥样硬化的干预作用；20032003年，中国动脉硬化杂志（第年，中国动脉硬化杂志（第5 5期）：血脂康对载脂蛋白期）：血脂康

12、对载脂蛋白E E基因敲除基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响小鼠动脉粥样硬化的影响ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞模型 ApoEApoE在体内胆固醇转运过程中作为脂蛋白在体内胆固醇转运过程中作为脂蛋白配体发挥作用，配体发挥作用，当当ApoEApoE缺乏时，由其诱导的胆固醇外流受缺乏时，由其诱导的胆固醇外流受阻，阻，ApoEApoE基因敲除小鼠基因敲除小鼠巨噬细胞转化为泡沫细巨噬细胞转化为泡沫细胞过程中，胆固醇酯蓄积更加明显，更容胞过程中，胆固醇酯蓄积更加明显，更容易形成易形成AsAs病变，是作为体外培养巨噬细胞病变，是作为体外培养巨噬细胞源性泡沫细胞模型进行干预研究的较理想源性泡沫细胞模型进

13、行干预研究的较理想选择。选择。中医药干预ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及机制ApoEApoE基因敲除小鼠基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞体外培养泡沫化腹腔巨噬细胞体外培养泡沫化干预干预PPARPPAR、CD36CD36、ABCA1ABCA1信号通路信号通路抑制抑制TLR4TLR4表达及炎表达及炎症反应症反应 拮抗细胞拮抗细胞内钙离子内钙离子水平水平 降低胆降低胆固醇浓固醇浓度度 脉心康胶囊脉心康胶囊降脂红曲降脂红曲虎杖、山楂虎杖、山楂及其配伍及其配伍一、脉心康干预ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化及其机制研究方药组成：方药组成：人参人参 银杏叶银杏叶 降脂红曲降脂红曲 绿茶绿茶 功效成分组方功

14、效成分组方人参人参皂苷皂苷银杏叶提取物银杏叶提取物降脂红曲超微粉降脂红曲超微粉茶多酚茶多酚中医药功效：益气活血解毒化浊脉心康胶囊研究分组 脉心康组脉心康组 洛伐他汀组洛伐他汀组 罗格列酮组罗格列酮组 生理盐水组生理盐水组 空白对照组空白对照组不加含药血清不加含药血清分别加入含药血清分别加入含药血清含药血清干预时间含药血清干预时间7272小时小时（激光共聚焦显微镜）（激光共聚焦显微镜）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内钙离子浓度的影响脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞PPAR蛋白表达的调控作用（免疫组化法（免疫组化法 ，PPAR蛋白表达）蛋白表达）脉心康对ApoE基

15、因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达的调控作用（免疫组化法（免疫组化法 ，ABCA1 ABCA1蛋白表达）蛋白表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞CD36蛋白表达的调控作用（流式细胞术（流式细胞术 ，CD36 CD36蛋白表达）蛋白表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞PPARmRNA表达的调控作用（原位杂交法，（原位杂交法，PPAR mRNA PPAR mRNA表达）表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1mRNA表达的调控作用（原位杂交法，（原位杂交法，ABCA1 mRNA表达）表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞

16、源性泡沫细胞CD36mRNA表达的调控作用（原位杂交法，（原位杂交法，CD36 mRNA CD36 mRNA表达）表达）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞培养液TNF-的影响（ELISAELISA法，法，TNF-TNF-）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞培养液IL-1的影响（ELISAELISA法，法，IL-1 IL-1）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇的影响（高效液相色谱法，总胆固醇（高效液相色谱法，总胆固醇 ）脉心康对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯的影响（高效液相色谱法（高效液相色谱法，胆固醇酯），胆固醇酯）脉心康

17、对ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值的影响结 论 以以ox-LDLox-LDL诱导诱导2424小时、小时、4848小时、小时、7272小时小时后，后，镜下观察可见巨噬细胞泡沫化程度随时间镜下观察可见巨噬细胞泡沫化程度随时间逐渐加重逐渐加重 脉心康含药血清干预后，细胞内胆固醇酯、脉心康含药血清干预后，细胞内胆固醇酯、总胆固醇含量及其比值均显著降低总胆固醇含量及其比值均显著降低 细胞内钙离子水平显著降低细胞内钙离子水平显著降低 PPARPPAR、ABCA1ABCA1蛋白及蛋白及mRNAmRNA表达均显著增加表达均显著增加 CD36CD36蛋白及蛋白及mRNAmRNA表

18、达显著减少表达显著减少 细胞培养液中细胞培养液中TNF-TNF-、IL-1IL-1含量显著降低含量显著降低结 论脉心康干预巨噬细胞泡沫化的机制，与以下脉心康干预巨噬细胞泡沫化的机制，与以下几方面有关：几方面有关：抑制胆固醇积聚抑制胆固醇积聚 拮抗细胞内钙超载拮抗细胞内钙超载 激活激活PPARPPAR信号通路信号通路 抑制炎症反应抑制炎症反应ApoEApoE（-/-/-）小鼠）小鼠腹腔巨噬细胞培养腹腔巨噬细胞培养分为分为B-GB-G组与组与ox-LDL+LPSox-LDL+LPS共孵育，并分别加药干预共孵育，并分别加药干预B B虎虎杖杖苷苷C C山山楂楂提提取取物物D D虎杖虎杖苷山苷山楂提楂提

19、取物取物组组E E洛洛伐伐他他汀汀组组F F罗罗格格列列酮酮组组G G模模型型组组A A空空白白对对照照分别观察分别观察0 0、2424、48h48h三个不同时相的三个不同时相的以下指标变化以下指标变化WesternWesternblotblotELISAELISATLR4TLR4NF-NF-B BTNF-TNF-IL-1IL-1数据整理、统计分析数据整理、统计分析二、解毒活血配伍干预ApoE基因敲除小鼠巨噬细胞泡沫化及机制研究巨噬细胞泡沫化 以以ox-LDLox-LDL与与LPSLPS联合诱导联合诱导ApoEApoE基因敲除小鼠腹腔巨基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化噬细胞泡沫化 联合诱导联合诱

20、导2424小时及小时及4848小时小时 显微镜下观察可见巨噬细胞均泡沫化显微镜下观察可见巨噬细胞均泡沫化 泡沫化程度随时间逐渐加重泡沫化程度随时间逐渐加重 且以且以ox-LDLox-LDL与与LPSLPS联合诱导组较单纯以联合诱导组较单纯以ox-LDLox-LDL诱导诱导组泡沫化程度更明显组泡沫化程度更明显 透射电镜下观察可见细胞内部结构呈不同程度破透射电镜下观察可见细胞内部结构呈不同程度破坏坏 4848小时空白组、模型组、解小时空白组、模型组、解毒活血配伍组细胞电镜图片毒活血配伍组细胞电镜图片（6000)6000)透射电镜观察结果不同时相各组巨噬细胞内钙离子浓度的变化#*#*（激光共聚焦显微

21、镜）（激光共聚焦显微镜）不同时相各组巨噬细胞内总胆固醇含量#*不同时相各组巨噬细胞内游离胆固醇含量*不同时相各组巨噬细胞内胆固醇酯含量*#*不同时相各组巨噬细胞内PPARmRNA相对表达量*#（RT-PCRRT-PCR法）法）不同时相各组巨噬细胞内ABCA1mRNA相对表达量*#（RT-PCRRT-PCR法）法）不同时相各组巨噬细胞内CD36mRNA相对表达量*#（RT-PCRRT-PCR法）法）不同时相各组巨噬细胞内TLR4蛋白相对表达量*#（Western blotWestern blot法）法）不同时相各组巨噬细胞内NF-B蛋白相对表达量*#（Western blotWestern bl

22、ot法）法）不同时相各组巨噬细胞内TNF-含量*#（ELISAELISA法）法）不同时相各组巨噬细胞内IL-1含量*#（ELISAELISA法）法）结 果虎杖苷、山楂提取物及两者配伍干预后：明显减轻细胞内部结构破坏程度明显减轻细胞内部结构破坏程度 显著上调细胞内显著上调细胞内PPARPPAR、ABCA1ABCA1的的mRNAmRNA表达表达,下调下调CD36CD36的的mRNAmRNA表达表达 降低降低TollToll样受体样受体4 4（TLR4TLR4）、核因子）、核因子-B B（NF-NF-B B）、）、IL-1IL-1及及TNF-TNF-的表达的表达 减少细胞内游离钙离子浓度减少细胞内游

23、离钙离子浓度 降低细胞内胆固醇酯、总胆固醇含量及其比值降低细胞内胆固醇酯、总胆固醇含量及其比值 两者配伍干预巨噬细胞泡沫化在部分指标方面明两者配伍干预巨噬细胞泡沫化在部分指标方面明显优于单用虎杖苷或山楂提取物显优于单用虎杖苷或山楂提取物 结 论 虎杖苷、山楂提取物及其配伍通过保护细胞超微结构 激活PPAR相关信号通络、抑制TLR4相关信号通路及炎症反应 拮抗细胞内钙超载 促进细胞内胆固醇外流等途径 抑制巨噬细胞泡沫化过程，延缓As的发生发展。其他学者的相关研究 张代娟等张代娟等取取ApoEApoE基因敲除小鼠胸主动脉，进行平滑肌细胞、基因敲除小鼠胸主动脉，进行平滑肌细胞、内皮细胞以及巨噬细胞培

24、养，以内皮细胞以及巨噬细胞培养，以LPSLPS诱导细胞泡诱导细胞泡沫化，以青心酮进行干预，沫化，以青心酮进行干预，发现青心酮能够明显降低血管平滑肌细胞、内皮发现青心酮能够明显降低血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞的细胞、巨噬细胞的TLR4TLR4蛋白含量，蛋白含量，在一定程度上减少在一定程度上减少AsAs病灶的形成，病灶的形成，推测青心酮可能通过推测青心酮可能通过TLR4TLR4信号转导途径发挥抗信号转导途径发挥抗AsAs作用。作用。第三部分本研究成果的临床应用本研究成果的临床应用益气活血解毒化浊复方制剂的临床应用脂欣康胶囊脉心康胶囊脂欣康胶囊脉心康胶囊 高脂血症高脂血症 动脉粥样硬化（颈动脉

25、粥样硬化）动脉粥样硬化（颈动脉粥样硬化）延缓斑块发展延缓斑块发展 减轻斑块减轻斑块 稳定斑块稳定斑块 冠心病不稳定性心绞痛冠心病不稳定性心绞痛解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块的意义与临床价值本本科科研研团团队队的的研研究究理论探讨解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块的意义与临床价值本科研团队的研究本科研团队的研究研究假说 解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块的意义与临床价值本科研团队的研究本科研团队的研究研究内容解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块的意义与临床价值本科研团队的研究本科研团队的研究研究结果解毒与活血配伍抗动脉粥样硬化稳定斑块的意义与临床价值

26、“虎杖山楂”药对的临床应用 降低血脂降低血脂 抗动脉粥样硬化抗动脉粥样硬化 稳定斑块稳定斑块 减轻脂肪肝减轻脂肪肝结 语 中医药以其多靶点干预的优势，对As泡沫化细胞的干预作用正逐渐受到关注。目前该领域的中医药研究仍存在一定的局限性，较多采用普通鼠或细胞株的单核/巨噬细胞源性泡沫细胞模型；对ApoE基因敲除小鼠As模型泡沫化细胞的干预及机制研究还较少。重视和加强后者的研究，有重要价值和良好的临床应用前景。继续挖掘能够干预As泡沫化细胞的中药并对其作用机制进行深入研究，对于防治As具有重要的意义。中西医结合事业如旭日东升（新浪博客（新浪博客.sina/zhangwengao）（新浪微博（新浪微博weibo/1345244940）热烈祝贺热烈祝贺第二届全国中西医结合心血管第二届全国中西医结合心血管病中青年论坛病中青年论坛第二届黄河心血管病防治论坛第二届黄河心血管病防治论坛圆满成功！圆满成功！