医学微生物实验5th课件.ppt

1、第五次实验课内容第五次实验课内容v1、细菌代谢产物检查，数码鉴定（示教）v2、肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况 （示教）EMB、SS平板、双糖铁培养基、半固体培养基v3、肥达试验（结果示教）v4、肉汤增菌结果血平板接种（操作，每组一份）v5、病例二讨论原理：原理：染色镜检染色镜检普通琼脂平板中菌落的形态普通琼脂平板中菌落的形态不能鉴别不能鉴别能够鉴别能够鉴别实验一实验一 细菌代谢产物检查，数码鉴定细菌代谢产物检查，数码鉴定细菌细菌代谢代谢产物产物分解代谢产物合成代谢产物生化反应?细菌菌落的色素观察细菌菌落的色素观察v金黄色葡萄球菌：产生只局限于菌落的脂溶性金黄色色素。v铜绿假单胞菌：产生带荧

2、光的水溶性色素，该色素可扩散至菌落周围，使培养基呈亮绿色。金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌细菌菌落的溶血现象观察细菌菌落的溶血现象观察v乙型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌:透明的无色溶血环。透明的无色溶血环。SLO or SLS？一、糖发酵试验一、糖发酵试验v原理：原理：不同细菌分解糖类的能力和分解代谢产物不同不同细菌分解糖类的能力和分解代谢产物不同v应用：应用：常用于肠道细菌的鉴定常用于肠道细菌的鉴定l结果判定结果判定 培养基变红色培养基变红色 阳性，记为阳性，记为 +培养基变红色，试管内有气泡培养基变红色，试管内有气泡 阳性，记为阳性，记为 +指示剂不变色指示剂不变色 阴性，记为阴性，记为 -葡萄

3、糖乳糖伤寒沙门菌糖发酵试验伤寒沙门菌糖发酵试验大肠埃希菌糖发酵试验大肠埃希菌糖发酵试验痢疾志贺菌糖发酵试验痢疾志贺菌糖发酵试验副伤寒沙门菌糖发酵试验副伤寒沙门菌糖发酵试验糖发酵试验糖发酵试验是吲哚（是吲哚（indole）、甲基红）、甲基红（methyl red test）、）、V-P（Voges-Prokauer test）和枸橼酸盐利用（）和枸橼酸盐利用（citrate test）四个试验的缩写，用于快速）四个试验的缩写，用于快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌（卫生细菌学检鉴别大肠杆菌和产气杆菌（卫生细菌学检查）查）细菌代谢产物检查，数码鉴定细菌代谢产物检查，数码鉴定二、靛基质（吲哚）产生试验二、靛

4、基质（吲哚）产生试验(I)(I)v原理：原理：v 分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色）分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色）v 靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲 醛结合而显红色醛结合而显红色(玫瑰吲哚玫瑰吲哚)v材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、蒸馏水）蒸馏水）u方法：方法：约约0.3ml的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物 注：加入吲哚试剂后切勿摇晃注：加入吲哚试剂后切勿摇晃u结果：结果：大肠埃希菌大肠埃希菌()红色红色 产气杆菌产气杆菌()黄色黄色红色吲哚红色吲哚

5、大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸甲酸、乙酸、乳酸pH 5.4培养基呈培养基呈橘黄色橘黄色（-）脱羧脱羧大肠埃希菌和产气杆菌都能发酵葡萄糖，产酸产气产气杆菌能使丙酮酸脱羧大肠杆菌三、甲基红试验（M）v材料：材料：葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖、蛋白胨、K K2 2HPOHPO4 4、蒸馏水）蒸馏水）v方法：方法：v结果：结果：大肠埃希菌，大肠埃希菌，红色红色 产气杆菌，产气杆菌，黄色黄色 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸甲酸、乙酸、乳酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇红色化合物红色化合物（+）脱羧脱羧四、VP试验（Vi）大肠埃希菌和

6、产气杆菌都能发酵葡萄糖，产酸产气产气杆菌能使丙酮酸脱羧大肠杆菌在碱性溶液中被氧化VP试剂试剂（李氏试剂）（李氏试剂）不能反应不能反应（-）反应30min二乙酰二乙酰+精氨酸胍基v方法：方法：暴露于空气中暴露于空气中v结果结果:大肠埃希菌，不出现红色（大肠埃希菌，不出现红色（）产气杆菌，产气杆菌，红色红色 （）大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌五、枸橼酸盐利用试验（C）枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH下降溴麝香草酚蓝 呈碱性变色培养基变蓝培养基产气杆菌能利用铵盐作为唯一氮源，利用枸橼酸盐作为唯一碳源 材料：材料：枸橼酸盐培养基枸橼酸盐培养基（枸橼酸钠、（枸橼酸钠、NH4H2PO4、MgSO4、K2H

7、PO4、NaCl、琼脂、蒸馏水、琼脂、蒸馏水、0.5%溴麝香草酚兰酒精溶溴麝香草酚兰酒精溶液）液）方法：方法：结果：结果：大肠埃希菌，绿色（大肠埃希菌，绿色（）产气杆菌，深蓝色（产气杆菌，深蓝色（）产气杆菌产气杆菌大肠杆菌大肠杆菌有无菌落？用于肠杆菌科属间鉴别大肠杆菌产气杆菌IMViC试验总结试验总结 分 解六、硫化氢产生试验六、硫化氢产生试验 原理：原理：材料：材料：醋酸铅培养基醋酸铅培养基（普通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、（普通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、醋酸铅溶液）醋酸铅溶液）含硫氨基酸含硫氨基酸硫化氢硫化氢遇铅盐或亚铁盐黑褐色沉淀黑褐色沉淀方法：方法：结果：结果：变形杆菌，黑褐色变形杆

8、菌，黑褐色 大肠埃希菌，不变色大肠埃希菌，不变色 对蛋白质的发对蛋白质的发酵酵吲哚试验吲哚试验硫化氢试验硫化氢试验对糖的发酵对糖的发酵糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验甲基红试验VP试验试验其他其他枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验v实验原理实验原理 该试剂条是由该试剂条是由2020个含干燥底物的小管所个含干燥底物的小管所组成，用细菌悬浮液接种。培养一定时间后，组成，用细菌悬浮液接种。培养一定时间后，通过代谢作用产生颜色的变化，或在培养后通过代谢作用产生颜色的变化，或在培养后加入试剂后变色而观察结果。加入试剂后变色而观察结果。判读结果判读结果：每三项为一组，每组：每三项为一组，每组分值为分值为1 2

9、 4 1 2 4 分）将阳性反应分）将阳性反应的分值相加，得出数据编码，从的分值相加，得出数据编码，从API20EAPI20E编码手册中查细菌名称。编码手册中查细菌名称。（21）半固体培养基）半固体培养基(动力试验动力试验)大肠埃希菌大肠埃希菌 志贺菌志贺菌 伤寒沙门菌伤寒沙门菌 材料：材料：1、EMB培养基、培养基、SS琼脂平板琼脂平板、双糖铁培养基、双糖铁培养基2、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌选择培养基选择培养基肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况鉴别培养基鉴别培养基 伊红美蓝培养基（伊红美蓝培养基（EMB）EMB平板平板基

10、质基质 肉汤基础培养基肉汤基础培养基抑制物抑制物 伊红、美蓝伊红、美蓝底物底物 乳糖乳糖 指示剂指示剂 伊红、美蓝伊红、美蓝 碱性碱性 无色半透明菌落无色半透明菌落 酸性酸性紫黑色或紫红色，且有金属光泽紫黑色或紫红色，且有金属光泽菌落持点菌落持点为紫黑色或紫红色菌落为紫黑色或紫红色菌落为无色半透明菌落为无色半透明菌落抑制作用抑制作用抑制抑制G菌菌用途用途分离沙门菌和志贺菌属的分离沙门菌和志贺菌属的弱弱选择培养基选择培养基原理：（原理：（EMB平板平板)非致病菌非致病菌：致病菌：致病菌：美蓝美蓝 分分 解解乳糖乳糖伊红伊红结合结合紫黑色或紫红色化合物紫黑色或紫红色化合物不分解乳糖，菌落呈不分解乳

11、糖，菌落呈无色、半透明。无色、半透明。其它类似培养基？SS培养基培养基（Salmonella Shigella Agar Medium）SS平板平板基质基质肉汤基础培养基肉汤基础培养基抑制物抑制物胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫酸钠胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫酸钠底物底物乳糖乳糖指示剂指示剂中性红中性红 pH（6.88.0）碱性碱性黄色黄色 酸性酸性红色红色菌落持点菌落持点为粉红色菌落为粉红色菌落为无色半透明菌落为无色半透明菌落 抑制作用抑制作用抑制大肠杆菌及抑制大肠杆菌及G菌菌用途用途分离沙门菌和志贺菌属的分离沙门菌和志贺菌属的强强选择培养基选择培养基原理：（原理：（SS平板）平板）非致病菌非致

12、病菌：致病菌：致病菌：胆盐胆盐 分分 解解乳糖乳糖乳酸乳酸胆酸胆酸中心浑浊的粉红色菌落中心浑浊的粉红色菌落不分解乳糖，菌落呈不分解乳糖，菌落呈透明无色；透明无色；枸橼酸铁能指示硫化枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中氢的产生，使菌落中心呈黑色心呈黑色大肠埃希菌痢疾志贺菌大肠埃希菌与伤寒沙门菌双糖铁培养基双糖铁培养基（Double sugar Iron Medium）v成分 含酚红指示剂的pH7.6的蛋白胨水 500mL 琼脂(1.3%)6.5g 乳糖乳糖(1%)5g 葡萄糖葡萄糖(0.1%)0.5g 硫酸亚铁铵硫酸亚铁铵(0.02%)0.1g 硫代硫酸钠(0.02%)0.1gv用途 初步鉴别肠

13、道杆菌原理：原理：v只分解葡萄糖只分解葡萄糖 ：产少量酸产少量酸 上层培养基的酸上层培养基的酸+O+O2 2COCO2 2 +H+H2 2O O 蛋白胨代谢产物蛋白胨代谢产物 下层培养基不接触空气下层培养基不接触空气培养基呈酸性培养基呈酸性显黄色显黄色v葡萄糖、乳糖都分解葡萄糖、乳糖都分解v硫酸亚铁铵：硫酸亚铁铵：用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。只产酸只产酸产酸产酸&产气产气培养基略变碱培养基略变碱指示剂变红指示剂变红 肠道杆菌的生长结果肠道杆菌的生长结果 SS EMB 双糖铁双糖铁大肠埃希菌大肠埃希菌 粉红色大菌落粉红色大菌落 紫黑色或紫红色紫

14、黑色或紫红色 黄色黄色痢疾志贺菌痢疾志贺菌 无色细小无色细小 无色、半透明无色、半透明 上红下黄上红下黄 半透明菌落半透明菌落伤寒沙门菌伤寒沙门菌 无色细小无色细小 无色、半透明无色、半透明 上红下黄上红下黄 半透明菌落半透明菌落 黑色沉淀黑色沉淀特异性抗体（血清中）特异性抗体（血清中）诊断菌液诊断菌液肉眼可见的凝集现象肉眼可见的凝集现象检测试剂的成分检测试剂的成分病人体内的反应病人体内的反应伤寒或副伤寒病人伤寒或副伤寒病人O抗原抗原H抗原抗原含有含有伤寒沙门菌伤寒沙门菌O抗原抗原伤寒沙门菌伤寒沙门菌H抗原抗原甲型副伤寒沙门菌甲型副伤寒沙门菌H抗原抗原肖氏沙门菌肖氏沙门菌H抗原抗原肥达试验肥达

15、试验（WidalWidal test test）方法：方法：1 1、每孔加、每孔加0.5ml N.S0.5ml N.S2 2、倍比稀释病人血清，第、倍比稀释病人血清，第7 7孔不加做对照孔不加做对照3 3、每孔加、每孔加0.5ml0.5ml抗原抗原4 4、轻轻振荡混匀后，、轻轻振荡混匀后，3737孵育过夜孵育过夜结果观察结果观察+清澈透明，菌体形成凝块于管底清澈透明，菌体形成凝块于管底 +较透明，大部分菌体形成凝块于管底较透明，大部分菌体形成凝块于管底 +稍浑浊，较多细小凝集稍浑浊，较多细小凝集 +较浑浊，有细小凝集较浑浊，有细小凝集 浑浊，无凝集浑浊，无凝集血清凝集效价：血清凝集效价：(抗体

16、滴度抗体滴度)与定量与定量Ag产生明显凝集（产生明显凝集（+）的血清最高稀释倍数）的血清最高稀释倍数结果分析（结果分析（1）伤寒沙门菌伤寒沙门菌“O”O”效价效价1 1：8080 “H”“H”效价效价1 1：160160 副伤寒沙门菌副伤寒沙门菌“H”H”效价效价1 1：8080O O、H H效价正常值，肠热症可能性大效价正常值，肠热症可能性大正常值，可能性小正常值，可能性小O O高高H H不高：感染早期不高：感染早期oror交叉反应交叉反应O O不高不高H H高：预防接种、非特异性回忆反应高：预防接种、非特异性回忆反应有诊断价值有诊断价值vO抗原 沙门菌属间有交叉反应 IgMvH抗原 种特异

17、性-伤寒沙门菌 IgG 甲型副伤寒沙门菌 肖氏沙门菌 希氏沙门菌结果分析（结果分析（2）肉汤增菌结果血平板接种肉汤增菌结果血平板接种1 1、观察肉汤增菌的结果、观察肉汤增菌的结果2 2、接种、接种 视细菌的培养条件而用不同的平板视细菌的培养条件而用不同的平板血标本肉汤增菌血标本肉汤增菌血平板分离培养血平板分离培养革兰染色革兰染色血浆凝固酶血浆凝固酶+触酶试验触酶试验病例1病例二病例二 患者：男性，19岁。恶心、腹痛4h，伴水样腹泻3次入院就诊。无呕吐、寒颤。腹痛呈阵发性。既往体检无过敏史。体检：T38.5，BP134/75 mmHg，P100次/分，R16次/分。心肺正常。上腹压痛，而无反跳痛

18、。肝脾未触及。实验室检查：粪便镜检可见中性粒细胞，偶见红细胞。血象正常。尿正常。问题：问题：1 1该患者可能患了什么疾病？需与哪些疾病作鉴别诊断？该患者可能患了什么疾病？需与哪些疾病作鉴别诊断？2 2如何进行微生物学检查？如何进行微生物学检查？1 1、病例分析、病例分析：感染中毒引起腹痛和腹泻的可能原因有哪些？肿瘤食物过敏炎症性肠病溃疡腹外疾病肠易激综合征v主诉：阵发性腹痛、腹泻肠道感染肠道感染细菌细菌病毒病毒寄生虫寄生虫真菌真菌肠杆菌科：肠杆菌科：大肠埃希大肠埃希菌、志贺菌属、沙门菌菌、志贺菌属、沙门菌属属弧菌科：弧菌科：霍乱菌、副霍乱菌、副溶血性弧菌溶血性弧菌弯曲菌属：空肠弯曲菌弯曲菌属：

19、空肠弯曲菌球菌科：球菌科：金黄色葡萄金黄色葡萄球菌球菌等等轮状病毒、轮状病毒、Norwork病病毒和肠腺病毒和肠腺病毒等毒等溶组织阿米溶组织阿米巴、蓝氏贾巴、蓝氏贾第鞭毛虫、第鞭毛虫、隐孢子虫等隐孢子虫等念珠菌、念珠菌、曲菌、毛曲菌、毛霉菌等霉菌等初诊：细菌感染引起的急性胃肠炎初诊：细菌感染引起的急性胃肠炎何种细菌？主要的肠道细菌：主要的肠道细菌：大肠杆菌 志贺菌 沙门菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 幽门螺杆菌 空肠弯曲菌区别要点区别要点侵袭性（炎症性）侵袭性（炎症性）毒素性毒素性潜伏期潜伏期长，110天不等短，几小时3天不等发热发热多而时间长少见呕吐呕吐少见多见腹痛腹痛明显，有压痛多数轻，个别有

20、绞痛里急后重里急后重可有无脱水脱水较少见较多见大便性状大便性状脓血便和粘液稀便，便中有大量白细胞稀水样便，无脓血和粘液病理改变病理改变肠道粘膜受损肠道粘膜完整 毒素性：毒素性：霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、大肠埃希菌某些菌株、腊样芽胞杆菌、变形杆菌、气单胞菌等 炎症性：炎症性：志贺菌、沙门菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌某些菌株、小肠结肠炎耶尔森氏菌等 其他：其他：副溶血性弧菌v2、一般检查步骤系统鉴定分离培养初步判断标本采集肛拭子直接涂片染色镜检需氧培养微需氧厌氧培养产气荚膜梭菌等等弯曲菌属革兰染色镜检呕吐物粪便SS琼脂平板或麦康凯琼脂平板，中国蓝琼脂平板可疑菌落药敏试验初步生化反应初步血清学试验玻片凝集试验粪标本粪标本SSSS平板接种平板接种分区划线法（每组一份）分区划线法（每组一份）！实验报告病例一、病例二谢谢大家！