兽医现代监测诊断技术培训课件培训课件.ppt

1、兽医现代监测诊断技兽医现代监测诊断技术培训课件术培训课件 兽医监测诊断技术在动物疫病防控和兽医监测诊断技术在动物疫病防控和兽医公共卫生工作中具有重要作用，是预兽医公共卫生工作中具有重要作用，是预防、控制和扑灭重大动物疫病中的重要一防、控制和扑灭重大动物疫病中的重要一环，为养殖业健康发展和公共卫生安全提环，为养殖业健康发展和公共卫生安全提供保障。供保障。前言前言2兽医现代监测诊断技术培训课件提纲提纲p面临的复杂形势面临的复杂形势p动物疫病诊断技术现状动物疫病诊断技术现状 p检测技术发展方向与未来展望检测技术发展方向与未来展望 3兽医现代监测诊断技术培训课件1面临的复杂形势面临的复杂形势 4兽医现

2、代监测诊断技术培训课件 动物疫病种类多动物疫病种类多 农业部农业部一、二、三类动物疫病病种名录一、二、三类动物疫病病种名录中列入中列入157种；其中一类种；其中一类17种；二类种；二类77种；三类种；三类63种。种。OIE陆生动物卫生法典陆生动物卫生法典2010版中列入版中列入94种；种；包括多种动物共患病包括多种动物共患病26种；牛病种；牛病14种；种；绵羊和山羊病绵羊和山羊病11种；马病种；马病11种；猪病种；猪病8种；禽病种；禽病14种；种；兔病兔病2种；蜂病种；蜂病6种；其他疫病种；其他疫病2种。种。5兽医现代监测诊断技术培训课件新发动物疫病威胁新发动物疫病威胁p国外威胁：国外威胁：非

3、洲猪瘟（俄罗斯）等；p周边省威胁：周边省威胁：小反刍兽疫（西藏）、口蹄疫A型（2008年湖北）等；p新发亚型：新发亚型：口蹄疫亚洲I型（2005年出现）等。6兽医现代监测诊断技术培训课件动物疫病病原型别多、变异快动物疫病病原型别多、变异快口蹄疫：口蹄疫：7个型，多个亚型；我国O型、亚洲I型（2005年年4月传入中国）月传入中国）、A型流感：流感：A、B、C3个型；A型：H1H16亚型；H5亚型亚型：变异株不断出现 疫苗：-1、-4、-5株PRRS：1996年美洲型；2006年变异株；2009年欧洲型1株。另外另外，还有小反刍兽疫（西藏）、疯牛病、非洲猪瘟、尼帕病等外来重大疫病的威胁7兽医现代监

4、测诊断技术培训课件2010年列入国家监测计划的动物疫病（年列入国家监测计划的动物疫病（16种）种）n高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟n鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病n牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、非洲猪瘟、蓝舌病 国家强制免疫 动物疫病 外来动物疫病8兽医现代监测诊断技术培训课件主要疫病的国家指定监测方法主要疫病的国家指定监测方法病病 名名指定诊断方法指定诊断方法口蹄疫口蹄疫正向间接血凝试验、液相阻断正向间接血凝试验、液相阻断ELISA VP1-ELISA高致病性禽流感高致病性禽流感血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）猪瘟猪瘟正向间接血凝试验

5、、阻断正向间接血凝试验、阻断ELISA高致病性猪蓝耳病高致病性猪蓝耳病ELISA、鸡新城疫鸡新城疫血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）布鲁菌病布鲁菌病虎红平板试验、试管凝集试验虎红平板试验、试管凝集试验血吸虫病血吸虫病斑点斑点ELISA、免疫金标快速试纸条、免疫金标快速试纸条牛结核病牛结核病结核菌素变态反应试验结核菌素变态反应试验9兽医现代监测诊断技术培训课件地市级、县级实验室的适用试验技术地市级、县级实验室的适用试验技术p县级实验室县级实验室p地市级实验室地市级实验室u凝集试验（高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟、新城疫等病）；uELISA（猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等病）u县级实验室开展的试验技

6、术uRT-PCR技术（猪瘟，PRRS 等病）10兽医现代监测诊断技术培训课件省内诊断试剂使用的现状省内诊断试剂使用的现状 主要诊断试剂 提供单位有：p兰州兽医研究所p哈尔滨兽医研究所p猪瘟和口蹄疫O型正向间接血凝；p口蹄疫型、AsiaI和 O型液相阻断ELISA；p3ABC-ELISA，VP1-ELISA；p猪圆环病毒ELISA；p 禽流感H5血凝抑制抗原；p 鸡新城疫血凝抑制抗原；其他：其他：猪蓝耳病ELISA法国进口；猪伪狂犬、猪细小病毒ELISA荷兰赛迪诊断公司；猪蓝耳病RT-PCR，猪乙型脑炎RT-PCR，猪细小病毒PCR等北京爱德士元亨生物技术有限公司。11兽医现代监测诊断技术培训课

7、件疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样以口蹄疫为例以口蹄疫为例 抗体检测试剂品种抗体检测试剂品种 病原检测试剂品种病原检测试剂品种 正向间接血凝琼脂凝胶免疫扩散试剂液相阻断ELISA试剂盒非结构蛋白ELISA试剂盒(3ABC)结构蛋白ELISA试剂盒（VP1）免疫胶体金试剂盒（测抗体）RT-PCR试剂盒荧光RT-PCR试剂盒ELISA试剂盒免疫胶体金试剂盒（测抗原）反向间接血凝试剂12兽医现代监测诊断技术培训课件国内动物疫病诊断试剂存在的主要问题国内动物疫病诊断试剂存在的主要问题u技术方法：标准技术方法：标准?各企业生产诊断试剂的的标准不一。u诊断试剂：文号？诊断试

8、剂：文号？302个产品中，有新兽药证书产品7.6%，有生产批准文号产品4.3%，列入标准产品7%。u法规管理：完善？法规管理：完善？市场秩序混乱：国内生产企业不具有资质、产品无新兽药证书或批准文号、国外生产企业注册生产的产品进入国内未经注册、非法生产产品u 产品质量：不齐？产品质量：不齐？1.质量水平低，试验特异性不高，产品保质期短；2.适用范围窄，操作复杂；3.生产能力小，购买难；4.检测目的不明确（型/亚型、感染/免疫抗体等）。13兽医现代监测诊断技术培训课件国外动物疫病诊断试剂国外动物疫病诊断试剂 进口兽用诊断试剂质量好，但是成本高、购买周期长，有的不适合中国的实际情况。14兽医现代监测

9、诊断技术培训课件国内兽用诊断试剂问题之根源国内兽用诊断试剂问题之根源行业特点行业特点p产品种类多，成分复杂，生命周期长，技术含量高，质量要求严格，单位用量小p投入资金巨大，产品开发周期长p监管措施不完善监管措施不完善u研发：基础研究、高科技研究投入力度小，科研与生产脱节。u生产、经营：企业规模小、效率低、利润低，发展不均衡，且部分没有生产资质；诊断试剂注册审批程序繁琐，进入市场门槛高。u使用：盲目选择诊断试剂，采购、验收、保藏制度不健全。u产业化和商品化发展滞后，非法诊断试剂产品市场占有比例大。15兽医现代监测诊断技术培训课件动物疫病诊断试剂行业发展建议动物疫病诊断试剂行业发展建议先进的产学研

10、模式，提高自主创新能力，建设科研院所和企业的产业链 严格市场准入完善的质量监控体系，进行规范化、标准化管理p达到扩充兽用诊断试剂种类，提高产品质量，满足动物疫病监测、诊断工作需要16兽医现代监测诊断技术培训课件2动物疫病诊断技术现状动物疫病诊断技术现状17兽医现代监测诊断技术培训课件常用实验室检测技术常用实验室检测技术组织病理学检测技术组织病理学检测技术血清学检测技术血清学检测技术分子生物学检测技术分子生物学检测技术病原学检测技术病原学检测技术18兽医现代监测诊断技术培训课件组织病理学检测技术组织病理学检测技术p1.病理学检测技术病理学检测技术 是利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变

11、化对动物疫病进行诊断。p2.2.免疫病理学检测技术免疫病理学检测技术(免疫组织化学技术免疫组织化学技术)免疫组织化学方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原,又可发挥病理学检测所具有直观、抗原定位准确的特点,还可在脏器组织原位检测出病原（原位PCR）的同时，观察到组织病变与该病原的关系，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。19兽医现代监测诊断技术培训课件血清学检测技术血清学检测技术按其反应性质的不同可分为：按其反应性质的不同可分为：p凝集性反应凝集性反应(如凝集试验和沉淀试验)p标记抗体技术标记抗体技术(包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体等 特点：特点：敏感、快速（ELISA 只需要12小

12、时）。p补体参与的反应补体参与的反应(补体结合试验、免疫粘附血凝试验等)。p中和试验中和试验(病毒中和试验和毒素中和试验)特点：特点：时间长，约需要18小时才能获得结果。p免疫转印技术免疫转印技术。20兽医现代监测诊断技术培训课件正向间接血凝诊断技术正向间接血凝诊断技术p特点：特点：正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏感、特异性。p操作要点及注意事项：操作要点及注意事项：A.试验准备：试验准备：采集3只以上未免疫鸡全血混合制红细胞悬液；选用孔底应光洁透明无可见沉淀附着物的反应板(一次性的最好)；待检血清要新鲜，未腐败、溶血，无悬浮物。B.

13、操作过程：操作过程：尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。C.结果判定：结果判定：正确识别“+”的凝集现象。待检样品待检样品2待检样品待检样品1阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照21兽医现代监测诊断技术培训课件正向间接血凝反应原理图正向间接血凝反应原理图间接血凝抑制反应原理示意图间接血凝抑制反应原理示意图红细胞红细胞间接血凝反应原理示意图间接血凝反应原理示意图抗体抗体致敏红细胞致敏红细胞22兽医现代监测诊断技术培训课件联免疫吸附试验（联免疫吸附试验（ELISA）p具有灵敏度高、

14、特异性强、快速、简便、重复性好、安全灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、安全、适合大批量标准化检测、适合大批量标准化检测的特点。p是当前应用最广、发展最快的一项新技术，目前该方法已被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。p其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度计或酶标仪判定结果。其可分为以下几种方法：其可分为以下几种方法：23兽医现代监测诊断技术培训课件24兽医现代监测诊断技术培训课件常用的直接法常用的直接法ELISA（测抗体）（测抗体）25兽医现代监测诊断技术培训课件分子生物学检测技术分子生物学检测技术p用于动物疫病特异性快速诊断和病原基

15、因变异与进化分析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，为疫病防治提供基因理论分析依据。p核酸探针技术、基因序列分析核酸探针技术、基因序列分析 比如基因芯片试剂盒。p聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）（）（应用最广）应用最广）1.疫病的早期诊断和不完整病原的检测2.快速、准确、安全的检测病原体3.在病原体分类和鉴别中的应用PCR仪仪基因芯片仪基因芯片仪26兽医现代监测诊断技术培训课件p聚合酶链式反聚合酶链式反应（应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取病原微生物的特异DNA片段，从而为疾病诊断提供重要依据。特点：快速；特点：快速；敏感；敏感；步骤较多。步骤较

16、多。PCR反应原理图反应原理图27兽医现代监测诊断技术培训课件反转录反转录PCR技术技术p即即RT-PCRRT-PCR技术。用于检测技术。用于检测RNARNA病毒。病毒。首先提取总RNA，然后加入引物在反转录酶的作用下合成cDNA，加热变性成为单链cDNA后，加入与之互补的另一引物，进行PCR反应。p分为一步法和两步法两种分为一步法和两步法两种RTRT-PCR反应原理图28兽医现代监测诊断技术培训课件病原学检测技术病原学检测技术p1.细菌的分离与鉴定细菌的分离与鉴定p2.病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定 是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病毒进行分类鉴定的重要方法之一。如，此法称为检

17、测口蹄疫的黄金标准。但是对实验室能力要求较高，且耗时长。3.寄生虫检测寄生虫检测 寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种:虫卵检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查法。30兽医现代监测诊断技术培训课件诊断新技术及应用诊断新技术及应用p我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的快速快速诊断技术诊断技术以及能区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断技术技术。p目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下3种:1.免疫胶体金快速诊断试纸条免疫胶体金快速诊断试纸条 2.荧光荧光PCR 3.鉴别诊断技术鉴别

18、诊断技术 4.原位原位PCR技术技术31兽医现代监测诊断技术培训课件免疫胶体金快速诊断试纸条免疫胶体金快速诊断试纸条p特点：特点：操作简易，速度快快，10分钟内出结果，方便基层开展工作p目前已经有了口蹄疫、猪瘟、禽流感、血吸虫等病的胶体金快速诊断试纸条。p技术原理：技术原理：试纸条的正面和侧面32兽医现代监测诊断技术培训课件免疫层析免疫层析快速快速检测试纸结构及检测试纸结构及原理原理33兽医现代监测诊断技术培训课件实时荧光定量实时荧光定量PCR 与普通与普通PCR相比：相比：1.自动化程度高，极短的检测时间自动化程度高，极短的检测时间（没有了制胶和PCR产物电泳步骤，快速热循环仪也缩减了运行时

19、间，在30分钟内可以得到完美的实验结果）；2.敏感性为普通敏感性为普通PCR的的100倍；倍；3.直观的软件分析；直观的软件分析；4.有效解决有效解决PCR污染问题；污染问题；5.安全性更好。安全性更好。6.不足：不足：资金投入大，检测成本高。实时荧光定量PCR反应软件分析截图实时荧光定量PCR仪34兽医现代监测诊断技术培训课件鉴别诊断技术鉴别诊断技术p鉴别诊断技术的重要性：鉴别诊断技术的重要性：A：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术；B：从普遍免疫的动物群体中甄别出自然感染和带毒的动物。p该项技术的核心是基因工程技术、单克隆抗体技术单克隆抗体技术与诊断技术的综合运用，其科技水平高，

20、研究的难度叶较大。p单克隆抗体技术单克隆抗体技术 目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的金标快速检测卡和ELISA试剂盒（比如猪瘟）。35兽医现代监测诊断技术培训课件原位原位PCR分子病理学新技术分子病理学新技术p是一种将PCR技术与原位杂交技术结合起来的可以检测组织细胞中微量DNA或RNA且可精确定位的新技术。p特点：特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。p目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组织中寄生虫感染的报道。36兽医现代监测诊断技术培训课件3检测技术发展方向与未来展望检测技术发展方向与未来展望37兽医现代监测诊断技术培训课件血清学检测技术发展方向血清学检测技术发展方向u简单、快速便

21、于普及的快速诊断技术简单、快速便于普及的快速诊断技术 以胶体金标记技术为代表，操作简单、快捷，实现现地现用。u高度集成、自动化的仪器诊断技术高度集成、自动化的仪器诊断技术 以ELISA（全自动酶免工作站）为代表，可实现大规模操作，且灵敏度高、特异性强。38兽医现代监测诊断技术培训课件分子检测技术的发展方向分子检测技术的发展方向u自动化自动化 利用全自动仪器完成核酸提取、反应液配制、上机反应和结果分析的所有步骤多功能新型生物液体处理工作站：可以一机实现DNA/RNA提取和PCR反应建立 实时荧光定量PCR仪：可以一机实现上机反应和结果分析39兽医现代监测诊断技术培训课件高通量高通量 在提高灵敏度和特异性的基础上，实现一次检测分析所有常见疫病和对一种疫病分型的目的。检测和核酸序列分析的综合检测和核酸序列分析的综合 随着测序仪器设备的完善，将检测与序列分析结合的诊断技术将逐步应用于临床。分子检测技术的发展方向分子检测技术的发展方向40兽医现代监测诊断技术培训课件结束语结束语 正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保护人民身体健康。41兽医现代监测诊断技术培训课件 谢谢 谢谢 ！42兽医现代监测诊断技术培训课件