实验四-RNA的提取及其组分的鉴定课件.ppt

1、酵母核糖核酸的分离酵母核糖核酸的分离 及组分鉴定及组分鉴定 学习从酵母中提取学习从酵母中提取RNA和鉴定和鉴定RNA组分的方法。组分的方法。一、实验目的二、原理：二、原理：核酸（核酸（nucleic acid)核苷酸核苷酸(nucleotide)磷酸磷酸(phosphate)核糖核糖(ribose)嘌呤（嘧啶）碱嘌呤（嘧啶）碱Purine (pyrimidine)base 核苷核苷(nucleoside)RNA(ribonucleic acid)背景知识背景知识 细胞细胞RNA通常都是单链分子（但病毒通常都是单链分子（但病毒RNA双链、环状、双链、环状、线型等多种形式），由核糖、碱基（线型等多

2、种形式），由核糖、碱基（A、U、G、C）和磷）和磷酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的RNA不不断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白质合成的质合成的RNA有三类：转移有三类：转移RNA（transfer RNA）、核糖）、核糖体体RNA（ribosomal）和信使）和信使RNA（messenger RNA）。）。研究表明，研究表明，RNA不仅仅是遗传信息的中间传递体不仅仅是遗传信息的中间传递体（from DNA to proteinprotein）。）。RNA的功能总结起来可以分

3、的功能总结起来可以分为以下几类：控制蛋白质的合成；作用于为以下几类：控制蛋白质的合成；作用于RNA转录后加工转录后加工与修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细与修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细胞持家功能；遗传信息的加工与进化。胞持家功能；遗传信息的加工与进化。RNA和和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。酵母核酸中酵母核酸中RNA含量较多含量较多RNA可溶于碱性溶液，在可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸

4、沉碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的的粗制品。粗制品。RNA的分离的分离 RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸，可分别进行鉴定。碱和磷酸，可分别进行鉴定。组分鉴定组分鉴定核糖核糖+（嘌呤碱（嘌呤碱or嘧啶碱）嘧啶碱）+磷酸磷酸核苷酸核苷酸 三、材料与试剂三、材料与试剂 1、酵母、酵母2、0.04mol/L的的NaOH溶液溶液3、酸性乙醇溶液

5、、酸性乙醇溶液0.3mL浓盐酸加入到浓盐酸加入到30mL乙醇乙醇中中4、95乙醇溶液乙醇溶液5、乙醚、乙醚6、1.5mol/L硫酸溶液硫酸溶液7、浓氨水、浓氨水8、0.1mol/L硝酸银溶液硝酸银溶液9、三氯化铁浓盐酸溶液、三氯化铁浓盐酸溶液2mL10三氯化铁加入到三氯化铁加入到400mL浓盐酸中浓盐酸中10、苔黑酚乙醇溶液、苔黑酚乙醇溶液6g苔黑酚溶于苔黑酚溶于100mL95乙醇乙醇（4保存）保存）11、定磷试剂、定磷试剂（）（）17的硫酸溶液的硫酸溶液（）（）2.5钼酸氨溶液钼酸氨溶液（）（）10抗坏血酸溶液抗坏血酸溶液（）蒸馏水（）蒸馏水使用时按下比例临时配置（体积比）：使用时按下比例临

6、时配置（体积比）：17的硫酸溶液的硫酸溶液:2.5钼酸氨溶液钼酸氨溶液:10抗坏血酸溶液抗坏血酸溶液:蒸馏水蒸馏水1:1:1:2四、实验步骤四、实验步骤、酵母、酵母RNA的提取：的提取：取酵母取酵母1.0g（3片）、片）、0.04MNaOH+8ml研磨匀浆研磨匀浆沸水浴沸水浴20min 离心离心10min（3000r/min）冷却至室温冷却至室温收集上清液于离心管收集上清液于离心管 离心管中离心管中加入加入7mL酸性乙醇沉淀酸性乙醇沉淀RNA 离心离心3min（3000r/min）收集沉淀收集沉淀95%乙醇洗沉淀一次，乙醇洗沉淀一次，无水乙醇洗沉淀一次无水乙醇洗沉淀一次离心离心3min（300

7、0r/min）沉淀即为沉淀即为RNA粗品粗品离心离心3min（3000r/min）2、RNA组分的鉴定组分的鉴定RNA的水解：的水解：用用10m1.5mol/L硫酸溶液小心将硫酸溶液小心将RNA沉淀沉淀洗至试管中，沸水浴洗至试管中，沸水浴10min，冷却后离心，然后将上清液定容至，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取分别取1mL至两个至两个1.5mLEp管中留做定量用管中留做定量用,余下做定性分析。余下做定性分析。RNA组分的鉴定：组分的鉴定：（）（）嘌呤碱嘌呤碱取水解液取水解液1ml+浓氨水（浓氨水（5滴）滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物，观察嘌呤银化合物的絮状沉淀。的絮

8、状沉淀。（）核糖（）核糖取取0.5ml水解液水解液+0.2ml苔黑酚苔黑酚+2ml三氯化铁盐酸溶液，沸水浴三氯化铁盐酸溶液，沸水浴10min，观察颜色变化（亮绿色）观察颜色变化（亮绿色）（）磷酸（）磷酸取取0.2ml水解液水解液+0.8ml水水+1ml定磷试剂定磷试剂，沸水浴，沸水浴10min，观察颜色变，观察颜色变化（蓝色）化（蓝色）五思考题五思考题、如何得到高产量的、如何得到高产量的RNA粗品？粗品？、本实验、本实验RNA组分是什么？怎样验证？组分是什么？怎样验证？无水乙醇洗沉淀一次无水乙醇洗沉淀一次离心离心3min（3000r/min）沉淀即为沉淀即为RNA粗品粗品用用10ml 1.5m

9、ol/L硫酸溶液硫酸溶液小心将小心将RNA沉淀洗至试管中，沉淀洗至试管中，沸水浴沸水浴10min，冷却后离心，然冷却后离心，然后将上清液定容至后将上清液定容至100mL,分别取分别取1mL至两个至两个1.5mLEp管中留做定管中留做定量用量用,余下做定性分析。余下做定性分析。l（）核糖（）核糖取取0.5ml水解液水解液+0.2ml苔黑酚苔黑酚+2ml三氯三氯化铁盐酸溶液，沸水浴化铁盐酸溶液，沸水浴10min，观察颜色变化，观察颜色变化（亮绿色）（亮绿色）l（）磷酸（）磷酸取取0.2ml水解液水解液+0.8ml水水+1ml定磷试定磷试剂剂，沸水浴，沸水浴10min，观察颜色变化（蓝色），观察颜色变化（蓝色）