大学课程植物组织培养6细胞培养-组培课件.ppt

1、1)1)直接了解不同物质对细胞产生的影响直接了解不同物质对细胞产生的影响,排排除未知因素的干扰。（克隆羊）除未知因素的干扰。（克隆羊）2 2）外加物质对细胞作用的速度快，停止也外加物质对细胞作用的速度快，停止也快。快。3 3）理论上生产效率高。）理论上生产效率高。一一.由植物器官分离单细胞由植物器官分离单细胞1.1.机械法机械法特点：细胞不受酶的伤害作用；特点：细胞不受酶的伤害作用；无须质壁分离无须质壁分离2.2.酶解法酶解法特点：在某些情况下，可以得到比较纯的特点：在某些情况下，可以得到比较纯的目的细胞。目的细胞。把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同

2、的新鲜培养基上，这个过程称作继代。同的新鲜培养基上，这个过程称作继代。通过继代：增殖愈伤组织、提高其松散性。通过继代：增殖愈伤组织、提高其松散性。震荡的作用：破碎；匀化；换气。震荡的作用：破碎；匀化；换气。一一.一般技术一般技术1.1.分批培养分批培养分批培养：是指把细胞分散在一定容积的培养基分批培养：是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。在培中进行培养，目的是建立单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中主要营养物质耗尽时，细胞

3、的分裂和生长即行主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。停止。为使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代。为使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代。滞后期的长短主要取决于继代时原种培养细胞所滞后期的长短主要取决于继代时原种培养细胞所处的生长期和转入的细胞数量。处的生长期和转入的细胞数量。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。不能生长。（如何降低细胞培养的难度？）（如何降低细胞培养的难度？）条件培养基：在其中曾培养过一条件培养基：在其中曾培养过一段时间植

4、物组织的培养基。段时间植物组织的培养基。它可以缩短滞后期的长度。它可以缩短滞后期的长度。*为了获得充分分散的愈伤组织，最重要为了获得充分分散的愈伤组织，最重要的是一开始就尽可能使用易散碎的愈伤的是一开始就尽可能使用易散碎的愈伤组织。组织。*分批培养不是一种理想的培养方式。分批培养不是一种理想的培养方式。连续培养：是利用特制的培养容器进行大连续培养：是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。在培养规模细胞培养的一种培养方式。在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，在培养物的容积保持恒定过的培养基，在培养物的容积保持恒定的情况下，培养液中的

5、营养物质能够不的情况下，培养液中的营养物质能够不断得到补充。断得到补充。缺点：设备复杂；耗费人力缺点：设备复杂；耗费人力悬浮细胞悬浮细胞 体细胞胚体细胞胚悬浮细胞悬浮细胞 愈伤组织愈伤组织 体细胞胚体细胞胚对于单细胞、低密度悬浮细胞、或过于细对于单细胞、低密度悬浮细胞、或过于细小的细胞团，则应待形成较大的细胞团小的细胞团，则应待形成较大的细胞团后，在转到半固体培养基上诱导愈伤组后，在转到半固体培养基上诱导愈伤组织。织。1.1.条件培养基条件培养基在初始细胞浓度过低的悬浮培养中使用。在初始细胞浓度过低的悬浮培养中使用。看护培养物的代谢产物促进了细胞生长的看护培养物的代谢产物促进了细胞生长的活性。

6、活性。转速、冲程都要适中转速、冲程都要适中三三.悬浮培养细胞的同步化悬浮培养细胞的同步化同步培养：是指在培养中大多数细胞都能同步培养：是指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。同时通过细胞周期的各个阶段。（为什么要同步？如何同步？）（为什么要同步？如何同步？）1.1.饥饿法饥饿法2.2.抑制法抑制法四四.悬浮培养中细胞生长的计量悬浮培养中细胞生长的计量1.1.细胞计数细胞计数分离细胞团分离细胞团 计数计数2.2.细胞密实体积（细胞密实体积（PCVPCV）用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。示。手段手段离心离心本质是对新陈代谢能力的测定本质是对

7、新陈代谢能力的测定方法：方法：相差显微术法相差显微术法(胞质环流和核的存在胞质环流和核的存在)；四唑盐还原法（氯化三苯基四唑即四唑盐还原法（氯化三苯基四唑即TTCTTC还原成红色染料）；还原成红色染料）；荧光素双醋酸酯法（荧光素双醋酸酯法（活细胞内活细胞内FDA被脂酶裂解，将能发荧光的荧光素释放出被脂酶裂解，将能发荧光的荧光素释放出来，且荧光素不能自由穿越质膜所以就在完整的活细胞的来，且荧光素不能自由穿越质膜所以就在完整的活细胞的细胞质细胞质 中累计起来。死细胞核破损细胞中则不能积累。）；）；伊凡蓝法（只有活力已受损的细胞能够摄取该燃料，完整的活细胞则不伊凡蓝法（只有活力已受损的细胞能够摄取该

8、燃料，完整的活细胞则不能。）。能。）。3.3.细胞鲜重细胞鲜重滤去细胞沾着的多余水分再称重。滤去细胞沾着的多余水分再称重。4.4.细胞干重细胞干重6060下干燥下干燥1212h h再称重再称重五五.培养细胞活力的测定培养细胞活力的测定（以你们理解，何为细胞活力，可如何测定？）（以你们理解，何为细胞活力，可如何测定？）一一.培养方法培养方法1.1.平板培养法平板培养法镜检次数越少越好。镜检次数越少越好。注意不同物种有最适植板密度，也有临界密度。注意不同物种有最适植板密度，也有临界密度。2.2.看护培养法看护培养法特点：把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织特点：把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织

9、上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔。有一片滤纸相隔。该愈伤组织提供：营养；促进分裂的其它物质该愈伤组织提供：营养；促进分裂的其它物质3.3.微室培养法微室培养法用条件培养基代替了看护组织。用条件培养基代替了看护组织。二二.影响单细胞培养的因子影响单细胞培养的因子培养基的成分；初始植板细胞密度培养基的成分；初始植板细胞密度对于细胞分裂有关的因素缺乏精确的了解。对于细胞分裂有关的因素缺乏精确的了解。一一.突变体选择突变体选择细胞比完整植株更容易变异。细胞比完整植株更容易变异。二二.天然化合物的生产和生物转化天然化合物的生产和生物转化1.1

10、.细胞大量培养细胞大量培养高产细胞系建立高产细胞系建立“种子种子”培养培养大量培养大量培养生产上的两步法：先扩增生物量；再促进次生代生产上的两步法：先扩增生物量；再促进次生代谢产物的合成。谢产物的合成。2.2.天然化合物的生产天然化合物的生产大多产量有限，不稳定。大多产量有限，不稳定。3.3.生物转化生物转化4.4.细胞固定化细胞固定化目的：使细胞所处的理化环境与整体植株中所处目的：使细胞所处的理化环境与整体植株中所处的环境接近，从而发挥正常的代谢功能。的环境接近，从而发挥正常的代谢功能。通过培养基的循环供应：保证营养；避免反馈抑通过培养基的循环供应：保证营养；避免反馈抑制。制。平床培养系统；柱形培养系统平床培养系统；柱形培养系统5.5.诱导多倍性诱导多倍性作业：作业：1 复习讲授内容，熟悉各种细胞培养方法。复习讲授内容，熟悉各种细胞培养方法。