“癌症的基因诊断和反义核酸基因治疗治疗”课件.ppt

1、“癌症的基因诊断和反义核酸基因治疗治疗癌症的基因诊断和反义核酸基因治疗治疗”专题汇报专题汇报 一、一般情况介绍时间：9月11日9月17日地点：福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液内科学员来源：黑龙江 云南 江西 湖南 广东 南宁 福建讲授方式 CAI 博导+博士+技术员内容：理论和实验部分 理论部分：13个专题（讲座）实验部分：8项内容（示范）福建医科大学内科博士点福建医科大学内科博士点福建省福建省“211211工程工程”重点学科重点学科福建省科委的优先发展研究所福建省科委的优先发展研究所福建省教委和福建省卫生厅的重点学科福建省教委和福建省卫生厅的重点学科国家药品监督管理局的临床药

2、理基地国家药品监督管理局的临床药理基地专业技术人员专业技术人员6767人，教授人，教授6 6人，副高人，副高1010人人 国家级专家博导国家级专家博导3 3人人 硕导硕导9 9人人6262项科研成果（国际、国家、省部及省厅级）项科研成果（国际、国家、省部及省厅级）培养博士培养博士2222人人 硕士硕士4545人人研究方向研究方向 癌症的基因诊断和基因治疗癌症的基因诊断和基因治疗 细胞因子与造血调控细胞因子与造血调控 造血细胞培养与造血干细胞移植造血细胞培养与造血干细胞移植福建省血液病研究所简介福建省血液病研究所简介1 1、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望2

3、 2、基因转移在肿瘤治疗中的应用、基因转移在肿瘤治疗中的应用3 3、反义技术在体外净化中的应用、反义技术在体外净化中的应用4 4、癌症、癌症BclBcl-2-2基因基因5 5、癌症的、癌症的c-c-mycmyc基因基因 诊断及反义核酸基因治疗诊断及反义核酸基因治疗6 6、癌症、癌症MDR1MDR1基因基因7 7、慢粒白血病、慢粒白血病bcrbcr-ablabl融合基因的检测及基因治疗融合基因的检测及基因治疗8 8、寡脱氧核苷酸的合成及纯化、寡脱氧核苷酸的合成及纯化9 9、癌症基因缺损的测序诊断、癌症基因缺损的测序诊断1010、核酶在癌症基因治疗中的应用、核酶在癌症基因治疗中的应用1111、肽核

4、酸在癌症治疗应用中进展、肽核酸在癌症治疗应用中进展1212、白血病细胞因子自分泌及其意义、白血病细胞因子自分泌及其意义1313、裸鼠、裸鼠、ScidScid鼠肿瘤模型的建立及其应用鼠肿瘤模型的建立及其应用内容 理论1 1、免疫组化、免疫组化2 2、癌基因荧光定量、癌基因荧光定量PCRPCR3 3、癌细胞系的培养与保存技术癌细胞系的培养与保存技术4 4、FCMFCM5 5、癌症基因缺损的测序诊断技术癌症基因缺损的测序诊断技术6 6、基因药物反义核酸的纯化、基因药物反义核酸的纯化7 7、动物模型的建立及、动物模型的建立及 反义核酸治疗癌症动物实验技术反义核酸治疗癌症动物实验技术考试考试1.51.5

5、小时小时实验部分实验部分现代科学证明现代科学证明 人类所有的疾病都与基因变异或受损有关人类所有的疾病都与基因变异或受损有关人类现有的人类现有的1800018000种疾病种疾病第一类单基因病第一类单基因病 如如 血友病、多指病血友病、多指病第二类多基因病第二类多基因病 如癌症、糖尿病、如癌症、糖尿病、高血压、冠心病、哮喘病等高血压、冠心病、哮喘病等第三类获得性基因病第三类获得性基因病 如病毒性肝炎如病毒性肝炎二、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望二、反义核酸基因治疗癌症研究现状与展望基因:具有遗传效应的DNA片断人类总基因15.3万个 3.8万已肯定 11.5万个可能长度 为地球 太阳来回6次基

6、因组或称词典 20bp/second需11年读完DNA由碱基互补的两条单链组成，模板链称正义链 互补单链称反义链反义核酸 人工合成一段与靶基因mRNA以 碱基互补结合，从而阻断其表达 的寡核苷酸序列包括：反义DNA 反义RNA 核酶 Antisense OligodeoxynucleotidesAntisense Oligodeoxynucleotides AS-ODN AS-ODN反义核酸作为基因治疗药物必须具备的条件1 1、能进入靶细胞内，并有一定浓度、能进入靶细胞内，并有一定浓度2 2、细胞内长半衰期、细胞内长半衰期3 3、对抗细胞内、血浆和体液的核酶的降解、对抗细胞内、血浆和体液的核酶

7、的降解4 4、特异性识别靶细胞并稳定结合、特异性识别靶细胞并稳定结合5 5、能人工合成、能人工合成6 6、使用安全有效、使用安全有效注意注意1 1、AS-ONDAS-OND长度的优化选择长度的优化选择 16-20 16-20bpbp最佳最佳2 2、AS-ODNAS-ODN进入靶细胞内的机制进入靶细胞内的机制 蛋白受体介导的胞吞作用蛋白受体介导的胞吞作用 AS-ODNAS-ODN带负电荷带负电荷3 3、AS-ODNAS-ODN的修饰和细胞内稳定性的修饰和细胞内稳定性 甲基磷酸酯甲基磷酸酯 硫代磷酸酯硫代磷酸酯 肽核酸肽核酸HOPOOHH碱基碱基HCH2HOOHH碱基碱基HCH2HHOPOX-=O

8、1 1、新的化学物质、新的化学物质寡核苷酸寡核苷酸2 2、新的药物受体、新的药物受体mRNAmRNA3 3、新的受体结合方式新的受体结合方式碱基互补杂交碱基互补杂交4 4、新的药物受体结合反应、新的药物受体结合反应 RnaseRnase H H介导的靶介导的靶mRNAmRNA的降解的降解反义药物与传统药物的不同反义药物与传统药物的不同特异性强 准确性高 应用前景广阔组织分布组织分布 除脑以外的所有组织除脑以外的所有组织 主要为肾肝脾及骨髓主要为肾肝脾及骨髓AS-PS-ODNBcl-2 mRNA抑制细胞凋亡抑制细胞凋亡c-myc mRNA细胞增殖和分化细胞增殖和分化c-myb mRNA(p75)

9、造血细胞增殖和分化造血细胞增殖和分化MDR1 mRNA(p170)多药耐药多药耐药Bcr-abl mRNA(p210)抗凋亡抗凋亡反义核酸对肿瘤细胞株的作用反义核酸对肿瘤细胞株的作用细胞株细胞株:HL-60 K562 U937HL-60 K562 U937原代白血病细胞株原代白血病细胞株:AML ALL APL CMLAML ALL APL CML等等反义核酸作用的靶基因反义核酸作用的靶基因:BclBcl-2 c-2 c-myc myc c-c-fos fos c-c-sycsyc MDR MDR bcrbcr-abl abl p53p53反义药物对实体瘤动物模型的药效学研究反义药物对实体瘤动

10、物模型的药效学研究动物模型动物模型MMP-2MMP-2PKC-aPKC-ac-c-mycmycPKAIPKAI端粒酶端粒酶RNARNAC-C-rafraf-1-1PKAPKAbclbcl-2-2人结肠癌人结肠癌人膀胱癌人膀胱癌人黑色素瘤人黑色素瘤人肾癌人肾癌人恶胶质瘤人恶胶质瘤人肺癌人肺癌人结肠癌人结肠癌肝细胞癌肝细胞癌效果效果预防肝转移预防肝转移抗癌效果呈序列特抗癌效果呈序列特 异性和浓度依赖性异性和浓度依赖性显著抑制肿瘤生长显著抑制肿瘤生长,延长生存期延长生存期肿瘤生长抑制率为肿瘤生长抑制率为50%50%肿瘤缩小肿瘤缩小50%50%肿瘤生长呈剂量肿瘤生长呈剂量 依赖性降低依赖性降低肿瘤生长

11、呈剂量肿瘤生长呈剂量 依赖性抑制依赖性抑制抑制肝细胞癌生长抑制肝细胞癌生长癌细胞类型癌细胞类型靶基因靶基因反义药物治疗实体瘤的临床研究反义药物治疗实体瘤的临床研究ISIS5132 C-ISIS5132 C-raf raf 各种实体瘤、淋巴瘤各种实体瘤、淋巴瘤 临床临床IIII期期 部分病例延长疾病稳定期部分病例延长疾病稳定期7-107-10个月个月ISIS3521 PKC-a ISIS3521 PKC-a 各种实体瘤各种实体瘤,包括卵巢癌、包括卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、脑瘤前列腺癌、结肠癌、脑瘤 临床临床IIII期期 部分有效部分有效ISIS2503 Ha-ISIS2503 Ha-ras ra

12、s 间皮瘤、结肠癌、间皮瘤、结肠癌、胰腺癌等胰腺癌等 临床临床I I期期 部分病例延长疾病稳定期部分病例延长疾病稳定期Bcl-2c-mycc-myb MDR1Bcr-abl的表达、检测和的表达、检测和 反义核酸治疗的应用范围反义核酸治疗的应用范围略略核酶在癌症基因治疗中的应用核酶在癌症基因治疗中的应用核酶是指一类具有催化活性的核酶是指一类具有催化活性的RNARNA分子分子 可特异性地与靶可特异性地与靶RNARNA分子配对，分子配对，对底物进行切割，促进对底物进行切割，促进RNARNA的降解的降解 从而使其失去生物学功能从而使其失去生物学功能分六类：分六类：第一型内含子第一型内含子 第二型内含子

13、第二型内含子 RnaseRnase P P 发夹式核酶发夹式核酶 斧头式核酶斧头式核酶 锤头式核酶锤头式核酶NNNNNNNNNUXNNNNNNNNNNNNNNNNNA CNNNNNNN A C A U G A G C GG A N N N N N N N 催化部分催化部分 N N NN 前臂前臂后臂后臂N:A/C/G/UX:C/U/A切割点切割点1 1、KobayashiKobayashi等等MDR1MDR1基因转录物核酶基因转录物核酶 导入导入MOLT3/TMQ800MOLT3/TMQ800细胞系细胞系,对长春新碱的敏感性提了对长春新碱的敏感性提了3535倍倍3 3、将将bcrbcr/abl

14、abl接合区序列的锤头型核酶接合区序列的锤头型核酶 的的cDNAcDNA插入逆转录病毒载体插入逆转录病毒载体,导入导入 K562K562细胞细胞,抑制生长抑制生长,诱导凋亡诱导凋亡2 2、KashaniKashani等对等对H-H-rasras的核酶导入的核酶导入 人膀胱癌细胞株人膀胱癌细胞株EJEJ细胞细胞 体外生长受抑制体外生长受抑制,体内致癌性及侵袭力明显下降体内致癌性及侵袭力明显下降肽核酸在癌症治疗中的应用肽核酸在癌症治疗中的应用反义治疗反义治疗反基因策略：通过寡核苷酸反基因策略：通过寡核苷酸 与双链与双链DNADNA结合形成局部结合形成局部 的三链结构来抑制基因的转录的三链结构来抑制

15、基因的转录 肽核酸肽核酸基因原位修复基因原位修复OBOOP=OOOBOOP=OODNABNHNBO=O=ONH=N=PNA三、基因转移在肿瘤治疗中的应用三、基因转移在肿瘤治疗中的应用精确定位精确定位：两方面两方面(AFP CEA)有效性：有效性：安全性：安全性：基因表达量和持续时间的控制：基因表达量和持续时间的控制：1、转移基因的要求、转移基因的要求2、基因转移的载体、基因转移的载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体腺病毒载体腺病毒相关载体腺病毒相关载体物理转移（脂质体、裸物理转移（脂质体、裸DNADNA、生物枪）生物枪）逆转录病毒载体只能感染分裂细胞逆转录病毒载体只能感染分裂细胞腺病毒载

16、体不能将基因整合到细胞染腺病毒载体不能将基因整合到细胞染色体上色体上腺相关病毒载体则避免了上述缺点腺相关病毒载体则避免了上述缺点肿瘤基因的修饰肿瘤基因的修饰A A 肿瘤基因的修正肿瘤基因的修正 修复一个或多个缺陷基因修复一个或多个缺陷基因B B 前体药物代谢酶前体药物代谢酶 TK/GCVTK/GCV系统毒性作用和旁观效应系统毒性作用和旁观效应C C 肿瘤疫苗肿瘤疫苗 3、肿瘤基因治疗的策略、肿瘤基因治疗的策略未成熟树未成熟树突状细胞突状细胞提呈提呈成熟树成熟树突状细胞突状细胞第二信号肿瘤肿瘤细胞细胞消化处理消化处理抗原抗原+MHC1,肽复合物肽复合物共刺激分子共刺激分子基因转移特异抗原或佐剂基

17、因基因转移特异抗原或佐剂基因肿瘤肿瘤细胞细胞分泌细胞因子分泌细胞因子杀伤杀伤T T淋巴细胞毒细胞淋巴细胞毒细胞宿主免疫系统基因的修饰宿主免疫系统基因的修饰 T T细胞修饰细胞修饰白血病患者白血病患者移植物抗宿主移植物抗宿主反应（反应（+）异基因移植物异基因移植物白血病复发低白血病复发低白血病患者白血病患者 （同（同 卵双生或卵双生或 去除去除T T细胞的病人）细胞的病人）白血病复发率高白血病复发率高移植物抗白血病作用（移植物抗白血病作用（GVLGVL）B-B-细胞细胞+EBVEBVCTLCTL被杀灭被杀灭免疫缺陷免疫缺陷前前B B细胞逃脱细胞逃脱CTLCTL攻击攻击淋巴瘤淋巴瘤EBVEBV免疫

18、供者免疫供者取外周血取外周血CTLCTLGVL改变宿主对细胞毒药物的耐药性改变宿主对细胞毒药物的耐药性 用逆转录病毒转移用逆转录病毒转移MDR1MDR1基因基因 到小鼠祖细胞到小鼠祖细胞 已证实能减少化疗引起的骨髓移植已证实能减少化疗引起的骨髓移植1 1、反义药物因有反义药物因有6 6个条件，个条件，具有广阔的应用前景具有广阔的应用前景2 2、肿瘤细胞的死亡应包括坏死肿瘤细胞的死亡应包括坏死 和凋亡两个方面和凋亡两个方面3 3、bclbcl-2 c-2 c-myc bcrmyc bcr-abl abl MDR1MDR1基因基因 并非特异并非特异,加之调节多层次加之调节多层次 网络化网络化,其治疗效果有其局其治疗效果有其局 限性限性小结小结5 5、展望、展望 肽核酸与肽核酸与DNA形成三链结构形成三链结构4 4、反义核酸治疗与自杀基因治疗反义核酸治疗与自杀基因治疗 两系统的比较两系统的比较基因原位修复基因原位修复核酶对核酶对RNARNA的特异切割作用的特异切割作用传统药物针对蛋白质的功能传统药物针对蛋白质的功能反义核酸与靶反义核酸与靶RNARNA结合结合Thanks Everyone