基因诊疗和基因治疗培训课件.ppt

1、文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。本章讨论二大方面内容 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗1文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。一一.基因诊断基因诊断概念概念 ：利用现代分子生物学和分子遗传学利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，的技术方法，直接检测基因结构及其表直接检测基因结构及其表达水平是否异常达水平是否异常，从而对疾病作出诊断，从而对疾病作出诊断的方法。的方法。第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断2文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二二.基因诊断基因诊断特

2、点特点：针对性强，特异性高针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广实用性强，诊断范围广 3文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三三.基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术 生物芯片生物芯片 基因测序基因测序4文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 是指单链核酸分子（是指单链核酸分子（DNA或或RNA）在特定条件下，

3、）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据：主要依据：碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性 DNA与与DNA杂交：杂交：A=T、GC;DNA与与RNA杂交杂交:A=U、GC;变性：变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补碱基互补5文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。hybridization DNA:DNA 5 A T G

4、C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C6文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理，原理，可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。源核酸序列的存在。核

5、酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断，能与片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。源序列。探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。荧光素等）两大类。7文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.1.核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类 液相杂交液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；进行杂交反应

6、；固相杂交固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。液中的特异性探针进行杂交反应。常用固相杂交支持物：常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等硝酸纤维素膜、尼龙膜等 8文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针

7、制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针9文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.3.常用固相核酸杂交方法常用固相核酸杂交方法 Southern Southern 印迹杂交法印迹杂交法（Southern blotting Southern blotting）Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法（Northern blotting Northern blotting）斑点杂交或狭缝杂交法斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/Slot blot hybridizationSpot/Slot blot hybrid

8、ization）菌落杂交菌落杂交（colony hybridizationcolony hybridization）夹心杂交法（夹心杂交法（sanwichsanwich hybridization hybridization）原位杂交原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）10文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。(1)Southern 印迹杂交法印迹杂交法 （Southern blotting）限制性内切酶酶切 检测杂交信号检测杂交信号 提取提取

9、DNADNA Southern 法可用于检测特异的法可用于检测特异的DNA序列片断、序列片断、基因定位、分子量测定等。基因定位、分子量测定等。11文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（2 2）Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法 （Northern blotting Northern blotting）（其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述SouthernSouthern法）法）提取提取RNARNA样本样本RNARNA变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜转移至膜探针（标记探针（标记DNADNA或或RNARNA）

10、与之杂交）与之杂交显影显影或显色或显色检测信号。检测信号。NorthernNorthern法可用于检测组织细胞中总法可用于检测组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA 12文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（3 3）斑点杂交或狭缝杂交法：）斑点杂交或狭缝杂交法：基本过程：基本过程：将变性的将变性的DNADNA或或RNARNA直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交用标记探针与之杂交自显影或显色反应自显影或显色反应检测杂检测杂交信号交信号分析结果。分析结果。优点：优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少

11、；缺点：缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。13文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（4 4）菌落杂交）菌落杂交（colony hybridizationcolony hybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。14文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（5 5）夹心杂交法）夹心杂交法（sanwich hybridizationsanwich hybridization）ABREREREREABAB固相支持物片段片段B捕捉探针捕捉探针 片

12、断片断A 检测探针检测探针 本法优点：本法优点：特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。15文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（6 6）原位杂交）原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的进而检测特异的DNADNA或或RNARNA序列。序列。细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 D

13、NA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点：不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有有16文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术技术 PCRPCR是体外基因扩增技术。它利用体内是体外基因扩增技术。它利用体内DNADNA复制的复制的原理和原理和DNA

14、DNA变性与复性的性质进行目的基因变性与复性的性质进行目的基因DNADNA的大量的大量扩增。扩增。1.1.PCRPCR基本原理：基本原理：PCR技术技术在模板、在模板、dNTPdNTP、MgMg2+2+等条件下，用耐热等条件下，用耐热的的TaqTaq酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶，用合成的，用合成的DNADNA引物代替引物代替RNARNA引引物物，经过，经过DNADNA变性、变性、引物与引物与模板结合（复性）和延伸模板结合（复性）和延伸3 3个步骤的循环过程（个步骤的循环过程（2525 3030个循环），目的个循环），目的DNADNA可可扩增扩增100100万倍以上。万倍以上。17文档仅

15、供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（1 1）DNADNA模板的模板的变性变性 将待扩增将待扩增DNADNA加热到加热到95950 0C C左右，使双链左右，使双链DNADNA解开成解开成为单链为单链（即：使模板（即：使模板DNADNA或延伸后的双链或延伸后的双链DNADNA发生热变性发生热变性），），并游离于反应体系中作为模板；并游离于反应体系中作为模板；（2 2）模板与引物的结合（）模板与引物的结合（退火或复性退火或复性）将体系温度降至合适温度（将体系温度降至合适温度（55550 0C C左右），使加入左右），使加入的引物与模板的引物与模板DNADNA两

16、端（两端（33端）碱基序列互补结合。端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；例远大于模板自身的复性）；18文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（3 3）引物）引物延伸延伸 将体系温度升到将体系温度升到72720 0C C左右，左右，TaqTaq聚合酶催化聚合酶催化dNTPdNTP按碱基互补原则连接在按碱基互补原则连接在DNADNA引物引物33端，使引物延伸，端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。形成两条与模板互补的新链。以上为一次以上

17、为一次PCRPCR循环循环（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）按照上述步骤重复操作，按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。产物呈指数扩增。模板模板DNA 扩增倍数扩增倍数T=2n(n:循环次数循环次数)。19文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。PCRPCR技术原理示意图技术原理示意图20文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.PCR 2.PCR各要素及其作用各要素及其作用（1 1）模板模板 PCR PCR模板可以是模板可以是DNA

18、DNA或或RNARNA。以线性以线性DNADNA模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为10102 2 10105 5个拷贝；个拷贝；RNARNA作为模板时，作为模板时，需要：需要：RNA cDNA PCR,RNA cDNA PCR,称此为称此为RT-PCR.RT-PCR.（2 2）耐热）耐热DNADNA聚合酶聚合酶(Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶)是从耐热细菌体内提取的一种是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在聚合酶，可在95稳定稳定30分钟。从而保证分钟。从而保证PCR在在 9494变性变性 55退退火火7171延伸延伸 循环循环30次过程中不变性失活。次过程中不变

19、性失活。在在PCR中，中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。聚合酶应用最广泛。逆转录逆转录21文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（3 3）引物）引物 引物是根据已知序列的模板引物是根据已知序列的模板DNADNA待扩增区待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为般为1515 3030个碱基。个碱基。引物是引物是保证保证PCRPCR扩增产物的大小和特异性扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对的关键因素，其设计与合成对PCRPCR的成功至关的成功至关重要。重要。引物设计原则如下：引物设计原则如下：22文

20、档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。引物设计应符合以下基本原则：引物设计应符合以下基本原则：长度适宜，一般为长度适宜，一般为15 30个碱基；个碱基；G+C含量，一般为含量，一般为40 60；4种碱基应随机性分布；种碱基应随机性分布；引物自身不应存在互补序列；引物自身不应存在互补序列；两个引物之间不应有多于两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；个碱基的互补；引物引物3端不应有任何修饰；端不应有任何修饰；引物引物5可以修饰。可以修饰。23文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（4 4）缓冲溶液与）缓冲溶液与MgMg2

21、+2+PCR PCR技术常用技术常用1010 50mmol/L Tris-HCl50mmol/L Tris-HCl、Ph8.3Ph8.3 8.888.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的、偏碱缓冲液；并含有一定量的MgMg2+2+浓度；浓度；（5 5）dNTPdNTP浓度浓度 PCRPCR一般用一般用5050 200200mol/Lmol/L的的dNTPdNTP；并且；并且4 4种种dNTPdNTP浓度应相等；浓度应相等；24文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（6 6）参数）参数 变性温度与时间变性温度与时间 一般选择：一般选择：94940 0C C，3

22、030秒秒 退火温度与时间退火温度与时间 取决于引物长度、浓度取决于引物长度、浓度 和和G+CG+C含量，含量，一般选择：一般选择：Tm-5Tm-5 延伸温度与时间延伸温度与时间 一般选择：一般选择：7070 7575 循环次数循环次数 取决于模板浓度，取决于模板浓度，一般循环：一般循环：3030次次25文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。PCRPCR操作操作 各种各种PCRPCR反应的操作基本相同，只是根据反应的操作基本相同，只是根据 引物与靶序引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。列不同，选择不同的反应体系和循环参数。将将PCRPCR反应

23、管置于反应管置于DNADNA自动化热循环仪上，输入各种循自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使环参数，使DNADNA扩增在热循环仪上很方便地完成。扩增在热循环仪上很方便地完成。PCRPCR技术优点技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何要求不高，能快速、特异地扩增任何DNADNA片断。片断。PCRPCR缺点缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。26文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.PCR3.PCR产物分

24、析产物分析（1 1）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（可用琼脂糖（AgroseAgrose）或聚丙烯酰胺（）或聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）凝）凝胶电泳检测胶电泳检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。同时应以标准同时应以标准DNADNA分子量作平行对照，凝胶中加分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。照。（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。此法即可满足检测要求。）27文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，

25、请联系网站或本人删除。（2 2）点杂交分析法）点杂交分析法 该法有该法有2 2种：种：将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；将不同的探针固定在膜上，再用有标记的将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCRPCR产物产物 与之杂交。与之杂交。本法有助于检测突变本法有助于检测突变DNADNA类型，用于人类遗传病类型，用于人类遗传病诊断合某些基因的分析。诊断合某些基因的分析。(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。当扩增产物时多条带时，用此法更合适。)28文档仅供参考，不能作为科学依据，

26、请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。(三三)生物芯片生物芯片 DNADNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。29文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。(四四)基因测序基因测序 即，即，DNADNA碱基序列分析，这是最确切、最直接碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。的基因诊断方法。目前常用的方法为目前常用的方法为Maxam-GilbertMaxam-Gilbert建立的建立的化学化学裂解法裂解法和和SangerSanger建立的建立的双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法。30文档仅供参考，不能作为科学依据

27、，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。四四.基因诊断的临床应用基因诊断的临床应用(一一)遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断(二二)肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断(三三)感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断31文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。举例：举例：镰刀状红细胞贫血镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子珠蛋白基因的第六个密码子A ATT 表达产物：表达产物：谷谷氨酸氨酸缬缬氨酸氨酸 一个碱基突变一个碱基突变缺失缺失1个个MstMst内切酶内切酶位点位点 正常人正常人：1.1kb1.1kb 患者：患者：1.3kb 1.3kb32文档仅

28、供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。53 53 1.1 kb 1.3kb Mst II酶切位点酶切位点（CCTNATG）正常基因正常基因突变基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb123 1、正常人、正常人 2、突变携带者、突变携带者 3、患者、患者33文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第二节第二节 基因治疗基因治疗 基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗的总体策略基因治疗的总体策略 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序 基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望34文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不

29、当之处，请联系网站或本人删除。一、基因治疗概念 狭义概念狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。35文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略 基因矫正基因矫正 基因置换基因置换 基因增补基因增补 基因失活基因失活 “自杀基因自杀基因”的应用的应用 免疫基因治疗免疫基因治疗 耐药基因治疗耐药基因治疗 36文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删

30、除。（一）基因矫正（一）基因矫正（gene correctiongene correction）对于致病基因中的对于致病基因中的异常碱基异常碱基进行精确修复，进行精确修复，使其恢复正常功能；使其恢复正常功能；（二）基因置换（二）基因置换（gene replacementgene replacement）用正常基因在原位用正常基因在原位替换替换致病基因，使细胞致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；完全恢复正常状态；37文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（三）基因增补（三）基因增补（gene augmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整

31、合到将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但，但致病基因未去除。致病基因未去除。（四）基因失活（四）基因失活（gene inactivation）：）：指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。表达，以抗肿瘤、抗病毒。反义反义RNA:干扰干扰mRNA的互补的互补RNA;反义反义DNA:干扰干扰DNA的互补的互补DNA.38文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，

32、请联系网站或本人删除。（五）（五）“自杀基因自杀基因”的应用的应用 自杀基因自杀基因 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因自杀基因”。自杀基因自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。但对正常细胞则无伤害作用。39文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（六）免疫基因治疗（六）免疫基因治

33、疗 将某些细胞因子（将某些细胞因子（IL-2IL-2、GM-CSFGM-CSF等）基因导入等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（七）耐药基因治疗（七）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。疗。40文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三、三、基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得（一）治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，在了解疾病发生的

34、分子机制基础上，选择对疾选择对疾病有治疗作用的特定基因。病有治疗作用的特定基因。如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组用酶切或探针杂交法从基因组DNADNA文库获得，从文库获得，从cDNAcDNA文库文库获取，获取，PCRPCR扩增，人工合成等。扩增，人工合成等。41文档仅供参考，不能作为科

35、学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体和非病毒载体。病毒载体病毒载体：逆转录病毒载体，：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；腺相关病毒载体等；非病毒载体非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。治疗基因转移入患者体内。42文档仅供参

36、考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择 基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。用体细胞。4

37、3文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。途径。一种一种为为直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo）：）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种另一种为为间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的

38、。人体内，达到治疗目的。44文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNA直接转移法直接转移法（四）基因转移方法（四）基因转移方法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）45文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。(五五)转导细胞的选择鉴定转导细胞的选择鉴定 标记基因技术标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术基因共转染技术 分子杂交技

39、术分子杂交技术 外源基因表达鉴定外源基因表达鉴定 (六六)回输体内回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。46文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。四、基因治疗的应用与展望四、基因治疗的应用与展望 (一一)基因治疗应满足的条件：基因治疗应满足的条件：1 1、单基因缺陷疾病、单基因缺陷疾病 2 2、仅限体细胞的基因治疗、仅限体细胞的基因治疗 3 3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。、靶细胞易获取、培养、及回输体内。4 4、治疗效果应胜过对病人的危害。、治疗效果应胜过对病人的危害。5 5、表达水平无需调控

40、且无副作用。、表达水平无需调控且无副作用。6 6、需经动物实验验证安全可行。、需经动物实验验证安全可行。47文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）基因治疗有待解决的问题（二）基因治疗有待解决的问题 1 1、难以获得真正有治疗作用的基因。、难以获得真正有治疗作用的基因。2 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。、外源基因的表达难以在体内精确调控。3 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。改变。4 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5 5、随机整合潜在的威胁。、

41、随机整合潜在的威胁。48文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。49文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。Eggs are coaxed to mature in a culture dish.Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it.50文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。While an egg is held stil

42、l with a pipette,a needle is used to drill through the zona pellucida,removing a plug.51文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。After ejecting the zona plug,the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material.52文档仅供参考，不能作为科学依据，请

43、勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。A cumulus cell from another egg is taken up into the needle.Cells called fibroblasts(or their nuclei)can also be used in this step.53文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material.54文档仅供参考，不能作

44、为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide.55文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。After roughly 24 hours,the activated egg begins dividing.The cells contain genetic material only from the injected cumulus

45、cell.56文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。By the fourth or fifth day,a hollow ball of roughly 100 cells has formed.It holds a clump of cells called the inner cell mass that contains stem cells.57文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。The blastocyst is broken open,and the inner cell mass is grown

46、 in a culture dish to yield stem cells.58文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。The stem cells,in turn,can be coaxed to grow into a variety of cells that might one day be injected into patients.-59文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。基因诊断与基因治疗（课堂练习）基因诊断与基因治疗（课堂练习）1.1.核酸分子杂交主要内容有核酸分子杂交主要内容有A.A.制备核酸

47、样本制备核酸样本 B.B.制备与标记特异探针制备与标记特异探针B.B.C.C.核酸样本的分离、变性、转移和固定核酸样本的分离、变性、转移和固定D.D.预杂交、杂交和漂洗预杂交、杂交和漂洗 E.E.检测杂交信号检测杂交信号2.2.下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是A.A.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异RNARNA序列片断序列片断 B.B.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异DNADNA序列片断序列片断C.C.NorthernNorthern印迹杂交法可用

48、于检测印迹杂交法可用于检测DNADNA或或RNARNAD.D.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测RNARNAE.E.原位杂交法可用于检测组织细胞中的原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNADNA或或RNARNA60文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.3.以下是关于以下是关于PCRPCR技术的叙述，错误是技术的叙述，错误是A.A.PCRPCR技术进行体外技术进行体外DNADNA扩增，其过程不同于体内扩增，其过程不同于体内DNADNA复制过程复制过程B.B.需要目的需要目的DNADNA两条链为模板两条链为模板C.C.需需TaqTaq 酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶D.D.需需RNARNA引物代替引物代替DNADNA引物引物E.E.PCRPCR需要需要DNADNA变性、复性和延伸变性、复性和延伸3 3个步骤的反复循环个步骤的反复循环4.4.基因诊断常用技术有基因诊断常用技术有A.A.核酸分子杂交核酸分子杂交 B.B.聚合酶链反应聚合酶链反应C.C.基因芯片基因芯片 D.D.基因测序基因测序D.D.E.E.以上都可以以上都可以61