基因诊断与基因治疗培训教程培训课件.ppt
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1、目目 录录基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗培训教程培训教程目目 录录目目 录录F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础F第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断F第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断F第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断F第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用 F第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 本章内容提要本章内容提要2基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录
2、录基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫地中海贫血进行诊断。血进行诊断。4基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义:定义:利用分子生物学技术,通过检测基因及基利用分子生物学技术,通过检测基因及基因表达产物的存在状态,对人体疾病作出诊断因表达产物的存在状态,对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是的方法。基因诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA,也可以是蛋白质或者多肽。,也
3、可以是蛋白质或者多肽。5基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或蛋白质水平变化,如病毒基因及或蛋白质水平变化,如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高;从低到高;l基因结构变化,如点突变引起基因失活、染色基因结构变化,如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。6基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性7基因诊断与
4、基因治疗培训教程目目 录录目目 录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交(核酸分子杂交(Nucleic acid hybridization)n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性(单链构象多态性(SSCP)n限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性(RFLP)nDNA序列测定(序列测定(DNA sequencing)n生物芯片(生物芯片(biochips)nWestern免疫印迹(免疫印迹(Western blotting)n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 8基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(一)核酸分子杂交(
5、一)核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件(温度、盐离指两条单链核酸在一定条件(温度、盐离子和有机溶剂浓度)下,按碱基互补的原则重子和有机溶剂浓度)下,按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。新配对形成双链的过程。9基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针10基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 提取提取DNA限制
6、性内切酶消化限制性内切酶消化DNA以产以产生特定长度的片段生特定长度的片段凝胶电泳分离凝胶电泳分离 变性处变性处理理DNA转印到膜上并使其牢固结合转印到膜上并使其牢固结合将标将标记的探针与膜上记的探针与膜上DNA片段杂交,分析杂交信片段杂交,分析杂交信号。号。1.Southern 印迹杂交印迹杂交(Southern blotting)11基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后,转移经变性琼脂糖凝胶电泳后,转移到固相支持物上,通过分子杂交检测特定到固相支持物上,通过分子杂交检测特定的的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。2.Northern印迹杂交印
7、迹杂交(Northern blotting)12基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3.斑点杂交(斑点杂交(dot blotting)将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,用于基因组中特定基因维素膜或尼龙膜上,用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。13基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 4.反向斑点杂交反向斑点杂交(reverse dot blotting)先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,将样品膜上,将样品RNA或或DNA标记变性后进行标记变性后
8、进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限,大大提高了基因能检测一种样品的局限,大大提高了基因诊断的效率诊断的效率。14基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性,可用人工合成的针对正常和突变子的稳定性,可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交,检测点突变,探针进行反向斑点杂交,检测点突变,大大大提高检测结果的可靠性。大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleo
9、tide,ASO)15基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录5.5.原位分子杂交原位分子杂交n荧光原位杂交荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)n挂锁挂锁FISH (FISH with padlock)16基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录荧光原位杂交(荧光原位杂交(FISHFISH)17基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 6.固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization)待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段(片段(A、B片段),分别
10、作为捕捉探针(不标记片段),分别作为捕捉探针(不标记的的A片段)和检测探针(标记的片段)和检测探针(标记的B片段),同时与片段),同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上,靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上,与靶基因序列与靶基因序列A部分杂交,再加入标记的检测探针,部分杂交,再加入标记的检测探针,检测探针与靶基因序列检测探针与靶基因序列B部分杂交,检测杂交信号。部分杂交,检测杂交信号。18基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 19基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(二)(二)聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polym
11、erase chain reaction,PCR)模板模板引物引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火20基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用nRT-PCRRT-PCRn荧光定量荧光定量PCRPCRn多重多重-PCR-PCRnPCR-ASOPCR-ASOnAS-PCRAS-PCRnPCR-SSCPPCR-SSCPnPCR-RFLPPCR-RFLP21基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录1.RT-PCR22基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录2.荧光定量荧光定量PCR荧光标记引物荧光标记引物2
12、3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 3.多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A:普通:普通PCRPCR;B B:多重:多重PCRPCR24基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录4.PCR-ASON N:正常基因;:正常基因;H H:杂合子基因;:杂合子基因;M M:突变基因:突变基因ASO1ASO2NHM25基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(三)(三)单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism,SSCP)DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不片段中碱基序列
13、不同,变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的同,变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同(单链构象多态性),利用迁移率的构象不同(单链构象多态性),利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。26基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意27基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 28基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 (四)限制性片段长度多态性分析(四)限制性片段长度多态性分析 (restriction fragmen
14、t length polymorphism,RFLP)由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失,在用限制性核酸内切酶消化时产生不同位点消失,在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。29基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列,在一个或数个限制性内切酶识别序列,在PCR扩扩增后用该限制酶切割增后用该限制酶切割PCR产物,根据电泳后酶产物,
15、根据电泳后酶切片段长度变化,即可作出诊断。切片段长度变化,即可作出诊断。PCR-RFLP30基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化31基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(五)(五)DNA序列测定(序列测定(DNA sequencing)32基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录DNA序列测定原理序列测定原理(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法)33基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录左侧:正常;右侧突变左侧:正常;右侧突变 序列分析用于
16、基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究34基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(六)生物芯片(六)生物芯片(biochips)n基因芯片(基因芯片(gene chips)n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)35基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图36基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性
17、高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化,但不适宜广泛使用可自动化,但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高,成本高,不适宜广泛效率高,成本高,不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片37基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录三、三、基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断:直接分析致病基因分子结构及表直接诊断:直接分析致病基因分
18、子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断:利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断:利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。定基因诊断的技术途径选择。38基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(一)直接诊断途径(一)直接诊断途径 必要条件:必要条件:被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制(突变位点或表达变化)被检基因致病的分子机制(突变位点或表达变化)已知已知3
19、9基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测(1 1)有限制性内切酶位点改变)有限制性内切酶位点改变40基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/(2 2)无限制性酶切位点改变)无限制性酶切位点改变 41基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替包括数十个碱基到数千个碱基的丢
20、失、插入、替换、重复和倒位等,以及染色体突变或畸变,包换、重复和倒位等,以及染色体突变或畸变,包括染色体的易位、缺失或染色三体(如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体(如唐氏综合征)等。征)等。2.2.基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 42基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血4
21、3基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 根据引物根据引物3 3 端的互补与否,设计一对与正端的互补与否,设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR(allele specific PCR)44基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录3.基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析45基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(二)间接诊断途径(二)间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基
22、因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测46基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 DNA多态性:多态性:指群体中的指群体中的DNA分子存分子存在至少两种不同的类型,即个体间同一染色在至少两种不同的类型,即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。或变异。多在进化中形成,本身并不致病,只是多在进化中形成,本身并不致病,只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记47基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录间接诊断:检测与致病
23、基因连锁的遗传标记间接诊断:检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记:三代遗传标记:RFLP(基于核酸分子杂交技术)(基于核酸分子杂交技术)VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)48基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录7.6kb13kb患患者者正正常常 HBS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N:正常;:正常
24、;H H:杂合子;:杂合子;P P:患者(纯合子);黄色区域为探针:患者(纯合子);黄色区域为探针49基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录 第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases50基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录一、血红蛋白病(一、血红蛋白病(hemoglobinopathy)(一)镰状细胞贫血病(一)镰状细胞贫血病(二)(二)-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病(二、血友病(Hemophilia)甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断 三、脆性三、脆性X综合征综合征
25、 51基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录(一)镰状细胞贫血病(一)镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 52基因诊断与基因治疗培训教程目目 录录目目 录录n正常的(正常的(N)的)的ASO探针:探针:5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突变的(突变的(M)的)的ASO探针:探针:5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者
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