碱裂解法抽提大肠杆菌质粒课件.ppt

1、碱裂解法抽提大肠杆菌质粒1碱裂解法抽提大肠杆菌质粒2 碱裂解法抽提大肠杆菌质粒31.取取1.4ml大肠杆菌培养液大肠杆菌培养液12000rpm离心离心2min，弃上清，收集菌体。，弃上清，收集菌体。注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培养基残留可能会影响后续实验。养基残留可能会影响后续实验。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒4碱裂解法抽提大肠杆菌质粒5碱裂解法抽提大肠杆菌质粒6碱裂解法抽提大肠杆菌质粒7碱裂解法抽提大肠杆菌质粒8碱裂解法抽提大肠杆菌质粒92.加加100l的溶液的溶液 I，使菌体充分悬浮，室，

2、使菌体充分悬浮，室温静置温静置3min。注意点：必须充分混匀至看不见沉淀，注意点：必须充分混匀至看不见沉淀，可用移液器吹打或者用混匀器振荡。可用移液器吹打或者用混匀器振荡。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒10碱裂解法抽提大肠杆菌质粒11碱裂解法抽提大肠杆菌质粒12碱裂解法抽提大肠杆菌质粒133.加入加入200l溶液溶液II，温和上下颠倒，温和上下颠倒2-3次，次，溶液转变为澄清透明。溶液转变为澄清透明。注意点：不可剧烈振荡。注意点：不可剧烈振荡。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒14碱裂解法抽提大肠杆菌质粒15碱裂解法抽提大肠杆菌质粒164.加入加入150l溶液溶液III，上下颠倒混匀数次，上下颠倒混匀数次，静

3、置静置2-3min。注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白色沉淀。色沉淀。5.12000 rpm离心离心5min。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒17碱裂解法抽提大肠杆菌质粒18碱裂解法抽提大肠杆菌质粒19碱裂解法抽提大肠杆菌质粒20碱裂解法抽提大肠杆菌质粒216.取上清，加等体积（取上清，加等体积（400l）的酚）的酚/氯仿氯仿/异戊醇，充分混匀，室温，异戊醇，充分混匀，室温，12000rpm离离心心5min。注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水冲洗。冲洗。碱裂解法抽提大

4、肠杆菌质粒22碱裂解法抽提大肠杆菌质粒23碱裂解法抽提大肠杆菌质粒24碱裂解法抽提大肠杆菌质粒257.吸上层水相，再加吸上层水相，再加1ml(约约2.5倍体积）预倍体积）预冷的无水乙醇冷的无水乙醇，混匀。，混匀。注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层酚氯仿。宁可损失一定上清。酚氯仿。宁可损失一定上清。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒26碱裂解法抽提大肠杆菌质粒27碱裂解法抽提大肠杆菌质粒28碱裂解法抽提大肠杆菌质粒298.4，12000rpm离心离心10min。9.弃上清，加入弃上清，加入0.5 ml 70乙醇，乙醇，4，12000 rpm离心离心5 min。10.弃上清，沉淀自然干燥弃上清，沉淀自然干燥10 min后，加后，加20l无菌水溶解。无菌水溶解。注意点：弃上清时尽量将酒精倾倒干净，注意点：弃上清时尽量将酒精倾倒干净，但注意不要将沉淀弃去。但注意不要将沉淀弃去。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒30碱裂解法抽提大肠杆菌质粒31碱裂解法抽提大肠杆菌质粒32碱裂解法抽提大肠杆菌质粒33碱裂解法抽提大肠杆菌质粒34碱裂解法抽提大肠杆菌质粒35