大肠杆菌基因工程课件2.ppt

1、基因表达系统基因表达系统原核表达系统原核表达系统真核表达系统真核表达系统蓝藻表达系统蓝藻表达系统大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统植物细胞表达系统植物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌基因工程(2)1第五章第五章 外源基因的表达外源基因的表达一、一、大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程二、酵母杆菌基因工程二、酵母杆菌基因工程三、哺乳动物基因工程三、哺乳动物基因工程四、高等植物基因工程四、高等植物基因工程五、外源基因表达产物的分离纯化五、外源基因表达产物的分离纯

2、化大肠杆菌基因工程(2)2 一、大肠杆菌基因工程一、大肠杆菌基因工程E.coli作为表达外源基因受体菌的特征作为表达外源基因受体菌的特征外源基因在外源基因在E.coli中高效表达的原理中高效表达的原理E.coli基因工程菌的构建策略基因工程菌的构建策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策利用重组利用重组E.coli生产人胰岛素生产人胰岛素大肠杆菌基因工程(2)3（一）（一）E.coli作为表达外源基因受体菌的特征作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌基因工程(2)4E.coli表达外源基因的优势：表达外源基因的优势：全基因组已测序，共有全基因组已测序，共有4,405个

3、开放阅读框架，个开放阅读框架，大部分基因生物学功能已鉴定；大部分基因生物学功能已鉴定；基因克隆表达系统成熟完善；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌基因工程(2)5E.coli表达外源基因的劣势：表达外源基因的劣势：缺乏对真核生物蛋白质的翻译后加工修饰系统，如缺乏对真核生物蛋白质的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化；糖基化、磷酸化；缺乏对真核生物蛋白质的复性功能，表达产物多以缺乏对真核生物蛋白质的复性功能，表达产物多以无活性的包涵体形式存

4、在；无活性的包涵体形式存在；内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；造成表达产物不稳定；细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量内毒素即细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量内毒素即可导致人体热原反应。可导致人体热原反应。大肠杆菌基因工程(2)6（二）外源基因在（二）外源基因在E.coli中高效表达的原理中高效表达的原理强化蛋白质生物合成强化蛋白质生物合成抑制蛋白质产物降解抑制蛋白质产物降解恢复蛋白质特异性空间构象恢复蛋白质特异性空间构象大肠杆菌基因工程(2)7启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝

5、数质粒拷贝数强化蛋白质生物合成强化蛋白质生物合成大肠杆菌基因工程(2)81、启动子、启动子(promoter,P)启动子：启动子：位于结构基因上游，能被位于结构基因上游，能被RNA聚合聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序序列，长列，长40-60bp 。大肠杆菌基因工程(2)9 因此，因此，E.coli表达载体所用的启动表达载体所用的启动子必须是子必须是E.coli启动子启动子。没有启动子，基因就不能转录。没有启动子，基因就不能转录。E.coli的的RNA聚合酶不能识别真核基因的聚合酶不能识别真核基因的启动子。启动子。大肠杆菌基因工程(2)10位于转录起始

6、点上游位于转录起始点上游35bp处，由处，由10bp组组成，成，5-TGACA。E.coli启动子是由两段彼此分开且又高度保守启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：的核苷酸序列组成：位于转录起始点上游位于转录起始点上游5-10bp处，由处，由6-8bp组成，组成，5-TATAAT，富含，富含A和和T，又称又称TATA盒。盒。-10区：区：-35区：区：大肠杆菌基因工程(2)11-35区区与与RNA聚合酶聚合酶s亚基结合亚基结合-10区区与与RNA聚合酶的核心酶结合聚合酶的核心酶结合 在转录起始点附近，在转录起始点附近，DNA被解旋成单被解旋成单链，链，RNA聚合酶聚合酶使第使第1

7、和和2个核苷酸形成磷酸二个核苷酸形成磷酸二酯键，并在其作用下向前推进，形成新生酯键，并在其作用下向前推进，形成新生mRNA链。链。TGACATATAAT-35区区-10区区+1位位 转录起始点转录起始点开始转录开始转录大肠杆菌基因工程(2)12-10区区和和-35区区的碱基组成及其间隔序列。的碱基组成及其间隔序列。启动子和外源基因转录起始点之间的启动子和外源基因转录起始点之间的距离距离。启动子的强弱取决于：启动子的强弱取决于：启动子是控制外源基因转录的重要启动子是控制外源基因转录的重要元件，元件，mRNA生成速率与其生成速率与其强弱强弱密切相关。密切相关。大肠杆菌基因工程(2)13-10和和-

8、35区与保守序列（区与保守序列（5-TATAAT、5-T GACA）相似度相似度越高，启动子活性越强。越高，启动子活性越强。-10和和-35区的间距越接近区的间距越接近17bp，启动子活性，启动子活性越强。越强。-10区和区和-35区的碱基组成及其间隔序列：区的碱基组成及其间隔序列：大肠杆菌基因工程(2)14 大多数大多数E.coli启动子与所属基因转录起始启动子与所属基因转录起始点之间的距离是点之间的距离是6-9bp，但对外源基因而言，但对外源基因而言，这个距离范围未必最佳。这个距离范围未必最佳。启动子和外源基因转录起始点之间的距离：启动子和外源基因转录起始点之间的距离：大肠杆菌基因工程(2

9、)151）启动子最佳距离的探测）启动子最佳距离的探测目的基因目的基因EEAEE启动子启动子A酶切开酶切开Bal31酶解酶解目的基因目的基因大肠杆菌基因工程(2)16 将目的基因插在一个强启动子下将目的基因插在一个强启动子下游，若克隆菌内检测不到游，若克隆菌内检测不到mRNA，有必要，有必要考虑调整启动子与基因之间的距离。考虑调整启动子与基因之间的距离。大肠杆菌基因工程(2)172）启动子的筛选：）启动子的筛选：探针质粒探针质粒pKO1的的报告基因报告基因：半乳糖激酶基因半乳糖激酶基因galK终止子终止子Amprori无启动子无启动子的的galKpKO13.9 kb 用同位素用同位素3 2P标记

10、标记ATP，测定从，测定从ATP转移到半转移到半乳糖的乳糖的32P的放射性强度，的放射性强度，可推算可推算galK表达的半乳糖激表达的半乳糖激酶的量，由此比较启动子的酶的量，由此比较启动子的强弱。强弱。大肠杆菌基因工程(2)183）启动子的构建：）启动子的构建：-35 区序列区序列-10 区序列区序列启动子启动子 来来 源源PlacPtrpP LPrecAPtacT T T A C AT T G A C AT T G A C AT T G A T AT T G A C AT A T A A TT T A A C TG A T A C TT A T A A TT A T A A TPtac=3

11、Ptrp=11 Plac 双双Plac串联串联=2.4 Plac乳糖操作子乳糖操作子色氨酸操作子色氨酸操作子 噬菌体早期操作子噬菌体早期操作子recA基因基因Ptrp-35区区+Plac-10区区大肠杆菌基因工程(2)194）启动子的可控性：）启动子的可控性：外源基因的全程高效表达，会对外源基因的全程高效表达，会对E.coli的的生理生化生理生化过程造成不利影响。过程造成不利影响。外源基因持续高效表达的重组质粒，在细外源基因持续高效表达的重组质粒，在细胞若干次分裂后，会部分甚至全部丢失，胞若干次分裂后，会部分甚至全部丢失，导致导致重组菌重组菌不稳定不稳定。大肠杆菌基因工程(2)20措施：措施：

12、利用利用可控性启动子可控性启动子，调整外源，调整外源基因的表达时序，通过启动子活性的定时基因的表达时序，通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长的某一特定阶段。细胞生长的某一特定阶段。大肠杆菌基因工程(2)21 目前广泛应用的目前广泛应用的E.coli可控性启动可控性启动子来自相应的操纵子，都含有与子来自相应的操纵子，都含有与阻遏蛋白阻遏蛋白特特异性结合的操纵子序列，其介导的外源基因异性结合的操纵子序列，其介导的外源基因在在E.coli中通常以极低的中通常以极低的基底水平基底水平表达。表达。大肠杆菌基因工程(2)22乳糖启动子乳糖启动

13、子Plac的可控性：的可控性：高效转录高效转录乳糖乳糖、IPTG诱导诱导PlacOlac乳糖、乳糖、IPTG可解除阻遏可解除阻遏作用，诱导作用，诱导Plac介导的目介导的目的基因表达。的基因表达。PlacOlac野生型野生型Plac与其控制区与其控制区Olac偶联在一起。偶联在一起。基底水平转录基底水平转录阻遏蛋白阻遏蛋白无诱导物存在时，无诱导物存在时，Plac受受阻遏蛋白阻遏，转录呈阻遏蛋白阻遏，转录呈基底水平表达。基底水平表达。大肠杆菌基因工程(2)23色氨酸启动子色氨酸启动子Ptrp的可控性：的可控性：PtrpOtrpPtrp受受Trp-阻遏蛋白复合物阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底水平

14、。的阻遏，转录呈基底水平。基底水平转录基底水平转录Trp阻遏蛋白阻遏蛋白高效转录高效转录OtrpPtrp在操作上，去除在操作上，去除Trp困难，困难，往往通过往往通过加入加入IAA，诱导，诱导Ptrp介导的目的基因表达。介导的目的基因表达。除去除去Trp高效转录高效转录OtrpPtrp或加入或加入IAA在培养体系中，去除在培养体系中，去除Trp或或加入加入3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸(IAA)，可解除阻遏作用。可解除阻遏作用。大肠杆菌基因工程(2)24 噬菌体启动子噬菌体启动子P L的可控性：的可控性：升温至升温至42时，时，cI857失活脱失活脱落，解除阻遏作用，落，解除阻遏作用，P L便可便可

15、介导目的基因高效表达。介导目的基因高效表达。高效表达高效表达P L目的基因目的基因42P L目的基因目的基因基底水平表达基底水平表达cI857P L受温度敏感的受温度敏感的cI857阻遏蛋阻遏蛋白阻遏，转录呈基底水平。白阻遏，转录呈基底水平。大肠杆菌基因工程(2)25 在大型发酵在大型发酵罐中迅速升温困罐中迅速升温困难，常使用难，常使用双质双质粒粒控制系统，间控制系统，间接控制目的基因接控制目的基因表达。表达。cI857PtrpAIAA 去阻遏去阻遏BP L目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用B表达表达P LPtrpATrp目的基因目的基因cI857大肠杆菌基因工程(2)26应是诱导型的，可通过简

16、单方式、使用廉价诱导应是诱导型的，可通过简单方式、使用廉价诱导物诱导，如温度诱导、物诱导，如温度诱导、IPTG诱导。诱导。最佳启动子必须具备条件：最佳启动子必须具备条件：必须是强启动子，能使外源基因表达量达细胞必须是强启动子，能使外源基因表达量达细胞总蛋白的总蛋白的10-30%以上；以上；应呈现低水平的基础转录；应呈现低水平的基础转录；大肠杆菌基因工程(2)272、终止子、终止子(terminator,T)强化转录终止的必要性：强化转录终止的必要性：过长转录物的产生会影响外源基因的表达。过长转录物的产生会影响外源基因的表达。外源基因在强启动子控制下表达，易发生外源基因在强启动子控制下表达，易发

17、生转录过头现象，转录过头现象，RNA聚合酶滑过终止子，继续聚合酶滑过终止子，继续转录邻近序列，形成长短不一的转录邻近序列，形成长短不一的mRNA混合物。混合物。大肠杆菌基因工程(2)28过长转录产物影响外源基因表达的原因：过长转录产物影响外源基因表达的原因：1）转录产物越长，）转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因转录所需的时间就相应增加，外源基因转录效率下降。效率下降。2）若外源基因下游紧接载体的重要功能基因，）若外源基因下游紧接载体的重要功能基因，则则RNA聚合酶在此处的转录，可能干扰其生物聚合酶在此处的转录，可能干扰其生物功能，甚至导致

18、其不稳定性。功能，甚至导致其不稳定性。大肠杆菌基因工程(2)294）过长的）过长的mRNA往往不能形成理想的二级结往往不能形成理想的二级结构，大大降低翻译效率。构，大大降低翻译效率。3）过长的）过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗。，增加工程菌无谓的能量消耗。大肠杆菌基因工程(2)30pCP1AmproriTcr筛选筛选Ampr、Tcs的转化子的转化子 也可通过也可通过探针质粒探针质粒筛筛选，选，唯一的克隆位唯一的克隆位点处于启动子和点处于启动子和报告基因报告基因的翻的翻译起始密码子之间，当终止子译起始密码子之间，当终止子插入该位点时，由启动

19、子介导插入该位点时，由启动子介导的报告基因转录被封闭，从而的报告基因转录被封闭，从而减少或阻断报告基因的表达。减少或阻断报告基因的表达。PT强终止子的选择与使用：强终止子的选择与使用：大肠杆菌基因工程(2)31 对终止作用较弱的终止子，可采用对终止作用较弱的终止子，可采用二聚二聚体体终止子串联的特殊结构，以增强转录终止作用终止子串联的特殊结构，以增强转录终止作用。常用终止子来自常用终止子来自E.coli rRNA操纵子上的操纵子上的rrn T1T2、T7噬菌体噬菌体DNA上的上的T。E.coli偏爱使用终止密码子偏爱使用终止密码子UAA，当其，当其后连上一个后连上一个U而形成四联核苷酸时，转译

20、终止效而形成四联核苷酸时，转译终止效率会得到进一步加强。率会得到进一步加强。大肠杆菌基因工程(2)323、核糖体结合位点、核糖体结合位点 外源基因在外源基因在E.coli中的高效表达不仅取决中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，还与于转录启动的频率，还与mRNA的的翻译起始翻译起始效率效率密切相关。密切相关。结构不同的结构不同的mRNA分子具有不同的翻译分子具有不同的翻译效率，差别高达数百倍。效率，差别高达数百倍。大肠杆菌基因工程(2)33 mRNA的翻译起始效率主要由其的翻译起始效率主要由其5端的结构序列决定，即端的结构序列决定，即核糖体结合核糖体结合位点位点(ribosomal bindi

21、ng site,RBS)。大肠杆菌基因工程(2)341）SD序列：序列：E.coli RBS的结构：的结构：识别核糖体小亚基中识别核糖体小亚基中16S rRNA 3端区域端区域3-AUUCCUCC-5，并与之专一性结合，将，并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，启动翻译。定位于核糖体上，启动翻译。位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序个核苷酸序列：列：5-UAAGGAGG-3。大肠杆菌基因工程(2)352）翻译起始密码子：）翻译起始密码子：E.coli绝大部分基因以绝大部分基因以AUG作为翻译作为翻译起始密码子，但有些基因也使用起始密码子，但有些基因也使用GUG

22、或或UUG作为翻译起始密码子。作为翻译起始密码子。大肠杆菌基因工程(2)36RBS对外源基因表达的影响：对外源基因表达的影响：1、SD序列的影响：序列的影响：mRNA与核糖体结合越强，翻译起始效率越与核糖体结合越强，翻译起始效率越高，结合程度取决于高，结合程度取决于SD序列序列(5-UAAGGAGG-3)与与16S rRNA的碱基互补性。的碱基互补性。以以GGAG尤为重要，尤为重要，4个碱基中任何个碱基中任何1个换成个换成C或或T，均会导致翻译效率大幅度下降。均会导致翻译效率大幅度下降。大肠杆菌基因工程(2)372、翻译起始密码子的影响：、翻译起始密码子的影响：E.coli起始起始tRNA可同

23、时识别可同时识别AUG、GUG和和UUG三种起始密码子，但识别频率不同：三种起始密码子，但识别频率不同：GUG为为AUG的的50%、UUG为为AUG的的25%。大肠杆菌基因工程(2)383、SD序列与起始密码子之间距离的影响：序列与起始密码子之间距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证序列与起始密码子之间的精确距离保证mRNA在核糖体上定位后，在核糖体上定位后，AUG正好处于正好处于P位位，这是翻译启动的前提。，这是翻译启动的前提。通常通常SD序列位于序列位于AUG前约前约7bp处处，在此间，在此间隔中少隔中少1个或多个或多1个碱基，均导致翻译起始效率个碱基，均导致翻译起始效率不同程

24、度的降低。不同程度的降低。大肠杆菌基因工程(2)394、SD序列与起始密码子之间序列的影响：序列与起始密码子之间序列的影响：SD序列下游碱基序列下游碱基为为AAAA或或UUUU时，翻译效时，翻译效率最高；为率最高；为CCCC或或GGGG时，翻译效率是最高值时，翻译效率是最高值的的50%和和25%。如：如：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶mRNA，在此位置上的最佳碱基，在此位置上的最佳碱基是是UAU或或CUU，如用如用UUC、UCA或或AGG取代之，取代之，酶的表达水平下降酶的表达水平下降20倍。倍。紧邻紧邻AUG的前的前3个碱基个碱基也会也会影响翻译起始效率。影响翻译起始效率。大肠杆菌基因工程(2)40

25、5、起始密码子后续若干密码子的影响：、起始密码子后续若干密码子的影响：从从AUG开始的前几个密码子的碱基序列开始的前几个密码子的碱基序列也至关重要，这一序列不能与也至关重要，这一序列不能与mRNA的的5端端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。在核糖体上的准确定位。大肠杆菌基因工程(2)41 目前广泛使用的目前广泛使用的E.coli表达型表达型质粒均含有与启动子来源相同的质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的。序列和间隔是最佳的。大肠杆菌基因工程(2)424、密码子、密码子生物体对密码子的偏爱性：生物体对密码子的偏

26、爱性：不同生物、甚至同种生物不同的蛋白质不同生物、甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率不同，编码基因，对简并密码子的使用频率不同，具有一定的偏爱性。具有一定的偏爱性。大肠杆菌基因工程(2)43生物体对密码子偏爱性的决定因素：生物体对密码子偏爱性的决定因素：生物基因组中的碱基含量；生物基因组中的碱基含量；密码子与反密码子相互作用的自由能；密码子与反密码子相互作用的自由能；细胞内细胞内tRNA的含量。的含量。大肠杆菌基因工程(2)441、生物基因组中的碱基含量：、生物基因组中的碱基含量：在富含在富含AT的生物（如单链的生物（如单链DNA噬菌体噬菌体 X174）基因组中，密码子第

27、基因组中，密码子第3位上位上U和和A出出现频率较高。现频率较高。在在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第第3位上含位上含G或或C的简并密码子占的简并密码子占90%以上。以上。大肠杆菌基因工程(2)452、密码子与反密码子相互作用的自由能：、密码子与反密码子相互作用的自由能：适中的作用强度适中的作用强度有利于蛋白质生物合成的迅有利于蛋白质生物合成的迅速进行。速进行。弱配对作用可能使氨酰基弱配对作用可能使氨酰基tRNA进入核糖体进入核糖体A位需要花费更多的时间。位需要花费更多的时间。强配对作用则可能使转肽后核糖体在强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐位逐出空载出

28、空载tRNA分子耗费更多的时间。分子耗费更多的时间。大肠杆菌基因工程(2)46如：如：GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少。等使用少。GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；等使用多；大肠杆菌基因工程(2)473、细胞内、细胞内tRNA的含量的含量 简并密码子使用频率与相应简并密码子使用频率与相应tRNA的的丰度丰度呈呈正相关。正相关。表达量高的基因含有较少种类的密码子，表达量高的基因含有较少种类的密码子，这些密码子又对应于高丰度的这些密码子又对应于高丰度的tRNA分子，以便分子，以便细胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白质。细胞

29、能以更快的速度合成需求量大的蛋白质。大肠杆菌基因工程(2)48密码子偏爱性对外源基因表达的影响：密码子偏爱性对外源基因表达的影响：原核生物和真核生物基因组中密码子的原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，因此哺乳动物基因在使用频率有较大差异，因此哺乳动物基因在E.coli中高效翻译的一个重要因素是密码子中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。的正确选择。大肠杆菌基因工程(2)49 使外源基因上的密码子在使外源基因上的密码子在E.coli中获得中获得最佳表达的最佳表达的策略策略：外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因大肠杆菌基因工程(2)5

30、01、外源基因全合成、外源基因全合成 按按E.coli密码子的密码子的偏爱性偏爱性规律，更换外源规律，更换外源基因中不适宜的简并密码子。基因中不适宜的简并密码子。如：如：重组人胰岛素、干扰素、生长激素在重组人胰岛素、干扰素、生长激素在E.coli中的高效表达均采用了这种方法。中的高效表达均采用了这种方法。大肠杆菌基因工程(2)51 可将这两个可将这两个tRNA编码编码基因克隆在另一高效表达质粒上基因克隆在另一高效表达质粒上，构建，构建双质粒表达系统双质粒表达系统。2、同步表达相关、同步表达相关tRNA编码基因编码基因如：如：人尿激酶原基因的人尿激酶原基因的412412个密码个密码子中，有子中，

31、有2222个个Arg密码子，其中密码子，其中7 7个个AGG、2个个AGA，而而E.coli中中tRNAAGG和和tRNAAGA丰度较低。丰度较低。大肠杆菌基因工程(2)525、质粒拷贝数、质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响：质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响：表达型质粒在每个表达型质粒在每个E.coli细胞中达数百细胞中达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程常发生在甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程常发生在受体细胞受体细胞对数生长期对数生长期，而此时正是细菌生理，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。代谢最旺盛的阶段。大肠杆菌基因工程(2)53 质粒的过度增殖、目的基因的高效表达质粒的过度增殖、目

32、的基因的高效表达会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性、目的基因表达水平下降。质粒的不稳定性、目的基因表达水平下降。措施：措施：将重组质粒的扩增纳入将重组质粒的扩增纳入可控制可控制的轨道。的轨道。大肠杆菌基因工程(2)54质粒扩增时序的控制：质粒扩增时序的控制：pCP3拥有温度可诱导的复制子。拥有温度可诱导的复制子。pCP3P LMCSoriAmpr28时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为60；42时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600，受体细胞表达的温度敏感型受体细胞表达的温度敏感型阻遏蛋白阻遏蛋白CI857失活

33、失活，外源基因表达。，外源基因表达。用温度可同时控制质粒拷贝数用温度可同时控制质粒拷贝数和外源基因表达。和外源基因表达。大肠杆菌基因工程(2)55（三）大肠杆菌基因工程菌的构建策略（三）大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型表达包涵体型表达分泌型表达分泌型表达融合型表达融合型表达寡聚型表达寡聚型表达整合型表达整合型表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大肠杆菌基因工程(2)561、包涵体型表达、包涵体型表达 E.coli表达的蛋白质在细胞内凝表达的蛋白质在细胞内凝集，形成无活性、集，形成无活性、不溶于水不溶于水的固体颗粒的固体颗粒，称为称为包涵体包涵体(Inclus

34、ion Bodies,IB)。大肠杆菌基因工程(2)57包涵体的性质：包涵体的性质：大部分存在细胞质中，基本上由蛋白质组成。大部分存在细胞质中，基本上由蛋白质组成。少量少量DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。、脂多糖等非蛋白分子。E.coli本身表达的蛋白本身表达的蛋白(如如RNA聚合酶、外膜蛋白聚合酶、外膜蛋白)、载体蛋白、载体蛋白(如标记基因表达产物如标记基因表达产物)。50%以上是以上是外源基因表达产物外源基因表达产物，氨基酸序列正确，氨基酸序列正确，但空间构象往往错误，无生物活性。但空间构象往往错误，无生物活性。大肠杆菌基因工程(2)58包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：1、

35、简化表达产物的分离操作、简化表达产物的分离操作 包涵体不溶于水、密度远大于细胞碎片包涵体不溶于水、密度远大于细胞碎片和其它细胞成分，菌体经超声波裂解后，通和其它细胞成分，菌体经超声波裂解后，通过高速离心，即可分离出来。过高速离心，即可分离出来。大肠杆菌基因工程(2)592、保持表达产物的结构稳定、保持表达产物的结构稳定 形成包涵体后，形成包涵体后，E.coli的蛋白酶降解的蛋白酶降解作用对外源蛋白的稳定性构不成威胁。作用对外源蛋白的稳定性构不成威胁。大肠杆菌基因工程(2)60包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：表达的目的蛋白无生物学活性，必须通过有表达的目的蛋白无生物学活性，必须通过有

36、效的效的变性变性、复性复性，才能获得正确空间构象。，才能获得正确空间构象。变变/复性效率对目标产物的收率至关重要，复性效率对目标产物的收率至关重要，也也是一是一技术难题。尤其目的蛋白分子中技术难题。尤其目的蛋白分子中Cys残基残基较多时，复性成功率相当低，一般不超过较多时，复性成功率相当低，一般不超过30%。大肠杆菌基因工程(2)61 外源基因在外源基因在E.coli中的表达量占细胞总蛋中的表达量占细胞总蛋白白20%以上时，表达产物倾向形成包涵体。以上时，表达产物倾向形成包涵体。以包涵体形式表达目的基因，关键是选以包涵体形式表达目的基因，关键是选择高效表达载体，择高效表达载体，高表达率高表达率

37、也是包涵体法的也是包涵体法的优势所在。优势所在。大肠杆菌基因工程(2)62包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作蛋白质变性复性的动力学原理：蛋白质变性复性的动力学原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXA1A2AnA 集聚的中间状态集聚的中间状态A：集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质U：变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质I：有效变有效变/复性过程的中间状态复性过程的中间状态N：天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质C：共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质X：脱离有效变：脱离有效变/复性过程而进入复性过程而进入大肠杆菌基因工程(2)63 共价修饰共价修饰和和集聚状态集聚状态的蛋白质不能进入复性的蛋

38、白质不能进入复性过程，成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质过程，成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质即属于这两种状态，需在体外进行变性（解除共即属于这两种状态，需在体外进行变性（解除共价修饰和驱散集聚体）、复性操作。价修饰和驱散集聚体）、复性操作。C1C2CnCUI1InNX1X2XnXA1A2AnA大肠杆菌基因工程(2)64包涵体的变性溶解：包涵体的变性溶解：用强变性剂如尿素、盐酸胍，通用强变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间相互作用，打断过离子间相互作用，打断包涵体包涵体蛋白质分蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。大肠杆菌基因工程(2)65便宜，但

39、溶解能力弱、且便宜，但溶解能力弱、且尿素分解的尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的氨基甲酰化。异氰酸盐能导致多肽链的氨基甲酰化。溶解能力强，但价格昂贵。溶解能力强，但价格昂贵。常用的变性剂：常用的变性剂：7M盐酸胍：盐酸胍：8M尿素：尿素：大肠杆菌基因工程(2)66包涵体的复性包涵体的复性：缓慢去除变性剂，使目的蛋白从缓慢去除变性剂，使目的蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂，使二硫键正常形成构，同时去除还原剂，使二硫键正常形成。大肠杆菌基因工程(2)67尿素：尿素：浓度降至浓度降至4M时，复性过程开始；时，复性过程开始；降至降至2M时复

40、性结束。时复性结束。盐酸胍：盐酸胍：浓度降至浓度降至4M时，复性过程开始；时，复性过程开始；降至降至1.5M时复性结束。时复性结束。大肠杆菌基因工程(2)68二硫键形成：二硫键形成：在包涵体变性体系中，始终存在在包涵体变性体系中，始终存在还原剂还原剂(如如DTT、-ME)，使多肽链中的巯基保持还原，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。变性结束后，游离的巯基必须重新配对形变性结束后，游离的巯基必须重新配对形成二硫键，多肽链重新折叠。成二硫键，多肽链重新折叠。大肠杆菌基因工程(2)69形成二硫键的主要方式：形成二硫键的主要方式：1）化学氧

41、化法：）化学氧化法：HSHS S S+2e+2H+需电子受体，最廉价的电子受体为空气，需电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，重折叠效果差。二硫键形成是随机的，重折叠效果差。大肠杆菌基因工程(2)702）二硫键交换：）二硫键交换：需氧化型和还原型谷胱甘肽需氧化型和还原型谷胱甘肽(GSSG和和GSH)，二硫键形成相对特异，重折叠效，二硫键形成相对特异，重折叠效果好。果好。HSHS+G-S-S-G S S2G-SH+大肠杆菌基因工程(2)71包涵体复性的方法：包涵体复性的方法：稀释复性稀释复性透析复性透析复性超滤复性超滤复性 柱上复性柱上复性大肠杆菌基因工程(2)72缺点：缺点：体

42、积增加较大，变性剂稀释速度快、体积增加较大，变性剂稀释速度快、不易控制。不易控制。直接加入缓冲液或复性液，放置过夜。直接加入缓冲液或复性液，放置过夜。一次稀释一次稀释梯度稀释梯度稀释连续稀释连续稀释稀释复性：稀释复性：大肠杆菌基因工程(2)73透析复性：透析复性：优点：优点：不增加体积，通过逐渐降低透析液浓不增加体积，通过逐渐降低透析液浓度、控制变性剂去除速度。度、控制变性剂去除速度。缺点：缺点：易形成无活性蛋白质聚体，不适合易形成无活性蛋白质聚体，不适合规模化生产。规模化生产。大肠杆菌基因工程(2)74超滤复性：超滤复性：缺点：缺点：样品量少时不适用，有些蛋白质在样品量少时不适用，有些蛋白质

43、在超滤过程中会发生不可逆变性。超滤过程中会发生不可逆变性。优点：优点：透析速度易控制，适合规模化生透析速度易控制，适合规模化生产。产。大肠杆菌基因工程(2)75柱上复性：柱上复性：包涵体变性后，在色谱柱上复性。包涵体变性后，在色谱柱上复性。优点：优点：复性回收率复性回收率高，达高，达90%以上；快速；以上；快速；工艺易放大；样品稀释倍数小工艺易放大；样品稀释倍数小。疏水柱复性疏水柱复性 凝胶柱凝胶柱复性复性大肠杆菌基因工程(2)762、分泌型表达、分泌型表达以可溶性或不溶性包涵体状态存在于以可溶性或不溶性包涵体状态存在于细胞质细胞质。通过运输或分泌，定位于通过运输或分泌，定位于细胞周质细胞周质

44、（内外膜（内外膜间的空隙），甚至穿过外膜进入培养基中。间的空隙），甚至穿过外膜进入培养基中。在在E.coli中表达的外源蛋白，按其在细中表达的外源蛋白，按其在细胞中的定位，分为两种形式：胞中的定位，分为两种形式：大肠杆菌基因工程(2)77蛋白质的分泌机制：蛋白质的分泌机制：E.coli周质中含有多种周质中含有多种分子伴侣分子伴侣，可阻止分泌蛋白，可阻止分泌蛋白随机折叠随机折叠，分泌在周质或培分泌在周质或培养基中的重组蛋白很少形成养基中的重组蛋白很少形成分子间二硫键。分子间二硫键。胞内胞内胞外胞外信号肽剪切酶信号肽剪切酶内膜内膜外膜外膜胞壁胞壁信号肽信号肽目标蛋白目标蛋白周质周质 与包涵体相比，

45、分泌型与包涵体相比，分泌型重组蛋白有较高比例的正确重组蛋白有较高比例的正确构象，生物活性的回收率高构象，生物活性的回收率高，且对蛋白酶不敏感。，且对蛋白酶不敏感。大肠杆菌基因工程(2)78 蛋白产物蛋白产物N端端信号肽信号肽序列的存在序列的存在是蛋白质分泌的前提。是蛋白质分泌的前提。大肠杆菌基因工程(2)79分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：2）目的蛋白易于分离）目的蛋白易于分离1）目的蛋白稳定性高）目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性是在细胞质中的其稳定性是在细胞质中的10倍。倍。大肠杆菌基因工程(2)80 多数真核生物成熟蛋白

46、多数真核生物成熟蛋白N端不含甲硫氨酸端不含甲硫氨酸残基，当其基因在残基，当其基因在E.coli中表达时，中表达时，N端的甲硫端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。氨酸残基往往不能被切除。3）目的蛋白末端完整：）目的蛋白末端完整：将外源基因与将外源基因与E.coli信号肽序列重组，一旦信号肽序列重组，一旦分泌型表达，分泌型表达，N端端的的甲硫氨酸甲硫氨酸残基便可在信号残基便可在信号肽剪切过程中被去除。肽剪切过程中被去除。大肠杆菌基因工程(2)81分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：1）E.coli的蛋白分泌机制不健全，真核基因的蛋白分泌机制不健全，真核基因很难在很难在E.coli中分泌型表达。中分

47、泌型表达。2）少数外源基因即使能分泌表达，表达率）少数外源基因即使能分泌表达，表达率也比包涵体方式低得多。也比包涵体方式低得多。大肠杆菌基因工程(2)82分泌型表达系统的构建分泌型表达系统的构建 这一过程严格依赖于这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。内外膜的通透性增大。绝大多数绝大多数E.coli不能将蛋白质直接分泌到不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些能将抗菌蛋白胞外，但有些能将抗菌蛋白(细菌素细菌素)分泌到分泌到培养基中。培养基中。大肠杆菌基因工程(2)83 将将细菌素释放蛋白细菌素释

48、放蛋白编码基因克隆在一编码基因克隆在一质粒上，与另一携带质粒上，与另一携带E.coli信号肽信号肽编码编码序序列和目的基因的表达质粒共转化列和目的基因的表达质粒共转化E.coli细细胞，可实现目的蛋白的分泌。胞，可实现目的蛋白的分泌。大肠杆菌基因工程(2)843、融合型表达、融合型表达 除直接表达外，还可将目的基因与受除直接表达外，还可将目的基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个开放型阅读框架进行表达，由这作为一个开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达的蛋白质称为种杂合基因表达的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。大肠杆菌基因工程(2)85 在融合

49、蛋白结构中，通常受体菌的蛋白位在融合蛋白结构中，通常受体菌的蛋白位于于N端，外源蛋白位于端，外源蛋白位于C端。端。通过在通过在DNA水平，引入水平，引入蛋白酶切割位点蛋白酶切割位点或或化学试剂特异性断裂位点化学试剂特异性断裂位点，可在体外从纯化的，可在体外从纯化的融合蛋白分子中回收外源蛋白。融合蛋白分子中回收外源蛋白。大肠杆菌基因工程(2)86融合型表达的优点：融合型表达的优点：1）目的蛋白稳定性高：）目的蛋白稳定性高：对分子量较小的多肽效果更佳。对分子量较小的多肽效果更佳。2）目的蛋白易于分离：）目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体等，进行利用受体蛋白成熟的抗体、配体等，进行亲和层

50、析，可快速获得高纯度的融合蛋白。亲和层析，可快速获得高纯度的融合蛋白。大肠杆菌基因工程(2)873）目的蛋白表达率高：）目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件。与受体蛋白共用一套完善的表达元件。4）目的蛋白溶解性好：）目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。大肠杆菌基因工程(2)88目的蛋白需要回收：目的蛋白需要回收：融合蛋白需裂解和进一步分离，才能融合蛋白需裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。获得目的蛋白。融合型表达的缺点：融合型表达的缺点：大肠杆