大肠杆菌感受态细胞的制备和转化课件.ppt
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- 关 键 词:
- 大肠杆菌 感受态 细胞 制备 转化 课件
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1、实验九,十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 在自然条件下在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种一般缺乏此种转移所必需的转移所必需的mobmob基因基因,因此不能自行完成从一个细胞到另因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需需将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后,将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后,细胞膜的通透性发生暂时性改变,
2、成为能允许外源细胞膜的通透性发生暂时性改变,成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞,称感受态细胞。分子进入的细胞,称感受态细胞。一一.实验原理实验原理1.概念概念感感 受受 态态 细细 胞胞大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转化转化(Transformation)(Transformation)是将外源是将外源DNADNA分子引入分子引入受体细胞受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段使之获得新的遗传性状的一种手段,它它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。的基本实验技术。转转 化化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转化过程所用的受体细
3、胞一般是限制修饰系统缺陷的变转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它它可以容忍外源可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法受体细胞经过一些特殊方法(如电击法如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法等化学试剂法)的处理后的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改细胞膜的通透性发生了暂时性的改变变,成为能允许外源成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞
4、的进入受体细胞的DNA分子通过复制分子通过复制,表达实现遗传信息的表达实现遗传信息的转移转移,使受体细胞出现新的遗传性状。使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子转化子(Transformant,即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞分子的受体细胞)。转转 化化转化过程转化过程大肠杆菌感受态细胞的制备和转化RbCl(KCl)法,法,CaCl2法,电击感受态制备等法,电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,法制备的感受态细胞转化效率较高,但制备较复杂,不适合实验室用但制备较复杂
5、,不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高,操作简便,但需电击感受态细胞转化效率高,操作简便,但需电击仪电击仪 CaCl2法简便易行法简便易行,且其转化效率完全可以满足,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积时,可加入占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70以下以下保存半年,因此保存半年,因此CaCl2法使用更为广泛法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法常用的感受态细胞制备方法大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 CaCl2法是以法是以Mendel和和Higa(1970)的发现为基)的发现为基础,其基本原理是
6、:细胞处于础,其基本原理是:细胞处于 0 4,CaCl2 低低渗溶液中,大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物渗溶液中,大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的中的 DNA 形成抗形成抗 DNA 酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物粘钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经附于细胞表面,经 42 90 秒热激处理,促进细胞秒热激处理,促进细胞吸收吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型,如氨苄青霉素耐药(型,如氨苄青霉素耐药(Amp r)得到表达,然后)得到表达,然后将此细菌培养物涂在
7、含将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上,的选择性培养基上,倒置培养过夜,即可获得细菌菌落。倒置培养过夜,即可获得细菌菌落。CaCl 2 法制备感受态细胞原理法制备感受态细胞原理大肠杆菌感受态细胞的制备和转化提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量试剂的质量 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染的污染大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的培养菌,最好从的培养菌,最好从7070或或-20-20甘油保存的菌种中直接转接用于
8、制备甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的长期时为好,可通过监测培养液的ODOD600600 来控制。来控制。DH5DH5菌株的菌株的ODOD600600 为为0.50.5时时,细胞密度在细胞密度在5 510107 7 个个/ml/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),),这时比较合适。密这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。度过高或不足均会影响转化效率。提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 质粒的质量和浓度质粒的
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