大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化课件.ppt
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- 大肠杆菌 感受态 细胞 制备 质粒 DNA 转化 课件
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1、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化实验目的实验目的实验原理实验原理实验试剂实验试剂实验步骤实验步骤注意事项注意事项大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。一、实验目的一、实验目的大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化二、实验原理二、实验原理 感受态细胞感受态细胞(Competent cells)受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(c
2、ompetent cell)。大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 转化(转化(transformation)是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 转化的方法:转化的方法:化学方法(热击法):使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞;电转化法:使用低盐缓冲
3、液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方法,简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化克隆的筛选:克隆的筛选:主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化重组重组DNADNA转化转化细菌过程示意图细菌过程示意图大肠杆菌感受态细胞的制备
4、与质粒DNA的转化三、实验试剂三、实验试剂 材料 大肠杆菌 E.coli DH5、pBS质粒、1.5ml 离心管(又称eppendorf管)试剂 LB培养基、0.1mol/L CaCl2、无菌水、氨苄青霉素(Amp)大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化四、实验步骤四、实验步骤 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法)从E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落,接种于LB液体培养基中,37振荡培养过夜。将该菌悬液以1:30100接种于LB液体培养基中,37 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培养;每人取1个离心管,加入1.5ml菌液
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