大肠杆菌基因工程课件1.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《大肠杆菌基因工程课件1.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 大肠杆菌 基因工程 课件
- 资源描述:
-
1、基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering 主讲教师:李黄金主讲教师:李黄金Email:Email:任课教师:张文峰、陈伟任课教师:张文峰、陈伟生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院1313大肠杆菌基因工程(1)1基因工程课程内容5234167基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程酵母基因工程动物基因工程植物基因工程基因工程进展大肠杆菌基因工程(1)2回顾:基因工程的基本目的是什么?回顾:基因工程的基本目的是什么?1 1、获取、整理遗传信息资源:、获取、整理遗传信息资源:破解生命之谜、利用基因资源破解生命之谜、利用基因资源2 2、
2、生产功能蛋白或化学原料、生产功能蛋白或化学原料 研究用途:基因功能研究,工具酶、免疫分析用抗原研究用途:基因功能研究,工具酶、免疫分析用抗原/抗体抗体 医药用途:蛋白医药用途:蛋白/多肽药物、抗原(疫苗)、抗体(治疗多肽药物、抗原(疫苗)、抗体(治疗/诊诊 断)、免疫毒素等。断)、免疫毒素等。工业用途:工业用酶、工业原料工业用途:工业用酶、工业原料3 3、改良生物性状:、改良生物性状:分子育种(改良分子育种(改良/创造)、基因治疗创造)、基因治疗/免疫免疫 大肠杆菌基因工程(1)3问题:如何利用基因资源?问题:如何利用基因资源?克隆目的基因克隆目的基因转入特定转入特定宿主宿主表达目的基因表达目
3、的基因生产蛋白生产蛋白/多肽:强调高效多肽:强调高效分子育种分子育种/基因治疗基因治疗/免疫:强调可控免疫:强调可控全基因:基因文库全基因:基因文库/PCR/PCR编码序列:编码序列:cDNAcDNA文库文库/RT-PCR/RT-PCR/合成合成选择宿主(特点、优缺点?)选择宿主(特点、优缺点?)构建表达载体(关键元件、调控原理?)构建表达载体(关键元件、调控原理?)转基因(转化系统、导入方法?)转基因(转化系统、导入方法?)大肠杆菌基因工程(1)4基因工程主要宿主系统 原核细胞原核细胞(Prokaryotic)真菌(真菌(Fungus )昆虫昆虫(Baculovirus)高等真核细胞(高等真
4、核细胞(Eukaryotic)人(基因治疗)人(基因治疗)动、植物(基因农场)动、植物(基因农场)大肠杆菌基因工程(1)5主要的蛋白质生产宿主系统主要的蛋白质生产宿主系统I 原核:原核:大肠杆菌大肠杆菌Escherichia coli*枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis*II 低等真核:低等真核:酿酒酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 毕赤酵母毕赤酵母Pichia pastoris*汉森酵母汉森酵母Hansenula polymopha*黑曲霉菌黑曲霉菌Aspergillus niger*III 高等真核:高等真核:中国仓鼠细胞(中国仓鼠细胞(
5、CHO)*昆虫细胞昆虫细胞杆状病毒杆状病毒*重点:各自优缺点是什么?重点:各自优缺点是什么?大肠杆菌基因工程(1)6表达载体的基本条件(关键元件)表达载体的基本条件(关键元件)1、高效的、可调控的表达元件、高效的、可调控的表达元件 1)转录与转录后水平:转录与转录后水平:DNA mRNA原核:启动子、终止子原核:启动子、终止子真核:启动子、终止子、增强子、真核:启动子、终止子、增强子、PolyA位点、内含子位点、内含子 2)翻译水平翻译水平原核:核糖体结合位点(如原核:核糖体结合位点(如SD序列)序列)真核:真核:5-端非翻译区(端非翻译区(5-UTR)3)翻译后水平翻译后水平:信号肽信号肽重
6、点:各宿主系统表达载体重点:各宿主系统表达载体的关键元件、调控原理与的关键元件、调控原理与 优化优化策略?策略?大肠杆菌基因工程(1)7表达载体的基本条件(关键元件)表达载体的基本条件(关键元件)3、便于筛选、便于筛选 大肠杆菌中的筛选标记(表达载体构建)大肠杆菌中的筛选标记(表达载体构建)最终宿主系统的筛选标记(转基因宿主筛选)最终宿主系统的筛选标记(转基因宿主筛选)4、便于目的基因亚克隆:多克隆位点、便于目的基因亚克隆:多克隆位点2、高拷贝数与遗传稳定、高拷贝数与遗传稳定 自主复制(高拷贝、不稳定)自主复制(高拷贝、不稳定)整合(低拷贝、稳定)整合(低拷贝、稳定)大肠杆菌基因工程(1)8典
7、典型型的的原原核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)9典典型型的的原原核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)10典典型型的的真真核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)11第三章第三章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程Escherichia coli(SEM,14000)大肠杆菌基因工程(1)12四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、大肠杆菌表达(生产)系统的优缺点一、大肠杆菌表达(生产)系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、
8、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章第三章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程(1)13一、一、大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌基因工程(1)14原核细胞与真核细胞的差别原核细胞与真核细胞的差别大肠杆菌基因工程(1)15生长速度惊人的大肠杆菌生长速度惊人的大肠杆菌大肠杆菌基因工程(1)16遗传背景清楚(4405个ORF),便于基因操作表达水平高,遗传较稳定 优良的工业性能:繁殖迅速、培养简单、操作方便、被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌基因工程(1)17胞内缺乏高效的表达产物折叠机制(形成包涵胞内
9、缺乏高效的表达产物折叠机制(形成包涵体),分泌机制不完善体),分泌机制不完善缺乏翻译后修饰加工系统(不能表达糖缺乏翻译后修饰加工系统(不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等)基化蛋白、结构复杂的蛋白等)细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌基因工程(1)18 初次尝试扫盲初次尝试扫盲 乱棍打枣入门乱棍打枣入门 系统优化中级系统优化中级 自成一体高手自成一体高手成功的实验都是一样的,成功的实验都是一样的,失败的实验各有各的不幸失败的实验各有各的不幸大肠杆菌基因工程(1)19二、大肠杆菌系统高效表达原理启动子(转录)终止子(转
10、录)核糖体结合位点(翻译)密码子(翻译)质粒拷贝数(转录)大肠杆菌基因工程(1)20大肠杆菌系统表达载体的基本元件大肠杆菌系统表达载体的基本元件A A、目的基因:、目的基因:编码外源蛋白的结构基因编码外源蛋白的结构基因B B、转录元件:、转录元件:启动子、终止子启动子、终止子C C、翻译元件:、翻译元件:核糖体结合位点、翻译起始位点核糖体结合位点、翻译起始位点D D、克隆元件:、克隆元件:克隆位点、复制原点、标记基因克隆位点、复制原点、标记基因E E、翻译后元件(非必须)、翻译后元件(非必须):信号肽、融合肽信号肽、融合肽大肠杆菌基因工程(1)21大肠杆菌系统表达载体的物理图谱大肠杆菌系统表达
11、载体的物理图谱大肠杆菌基因工程(1)221 1、启动子与外源基因表达、启动子与外源基因表达*是是DNADNA链上一段能与链上一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始RNARNA合成的合成的 序列。序列。*是基因表达最关键调控元件(没有启动子,基因就不能是基因表达最关键调控元件(没有启动子,基因就不能转录)。转录)。*启动子有种属特异性(如真核的在原核宿主中无效)启动子有种属特异性(如真核的在原核宿主中无效)*有组成型和诱导型二大类有组成型和诱导型二大类启动子启动子 (Promoter)(Promoter)大肠杆菌基因工程(1)23组成型与诱导型启动子组成型与诱导型启动子*无需诱
12、导无需诱导*整个生长过程一直不停地表达目的蛋白整个生长过程一直不停地表达目的蛋白*一般采用基础代谢关键酶基因的启动子一般采用基础代谢关键酶基因的启动子*不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物*表达量通常不高:过量或者有害表达影响细菌生长表达量通常不高:过量或者有害表达影响细菌生长组成型表达系统组成型表达系统大肠杆菌基因工程(1)24组成型与诱导型启动子组成型与诱导型启动子*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物*使生长相与表达相分开,避免表达与生长争营养使生长相与表达相分开,避免表达与生长争营养 和对菌体的
13、毒害和对菌体的毒害*可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解*特别适合解决有毒蛋白的表达特别适合解决有毒蛋白的表达*启动子是组成型的,但是启动子所依赖的转录酶是启动子是组成型的,但是启动子所依赖的转录酶是 诱导表达的,也属于诱导表达系统。诱导表达的,也属于诱导表达系统。诱导型表达系统诱导型表达系统大肠杆菌基因工程(1)25原核基因启动子原核基因启动子原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成:序列组成:(1)Pribnow盒,位于转录起始位点上游盒,位于转录起始位点上游510bp,一般,一般由由68个碱基
14、组成,富含个碱基组成,富含A和和T,故又称为,故又称为TATA盒或盒或10区。区。(2)35区,位于转录起始位点上游区,位于转录起始位点上游35bp处,故称处,故称35区,一般由区,一般由10个碱基组成。个碱基组成。大肠杆菌基因工程(1)26启动子保守序列启动子保守序列-35 区序列-10 区序列Pl lLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C A
15、T A T A A TPtac=3 Ptrp=11 PlacPtac=3 Ptrp=11 Plac大肠杆菌基因工程(1)27启动子的筛选AprorigalKpKO1终止子采用鸟枪法策略,将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用,可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆大肠杆菌基因工程(1)28常用原核基因启动子常用原核基因启动子lac(乳糖启动子乳糖启动子)trp(色氨酸启动子色氨酸启动子)tac(乳糖和色氨酸的杂合启动
16、子(乳糖和色氨酸的杂合启动子PL和和PR(噬菌体的左向和右向启动子噬菌体的左向和右向启动子)T7T7启动子启动子大肠杆菌基因工程(1)29启动子P乳糖启动子(Plac)负调控(lacI):OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起,在没有诱导物存在时,整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达;诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高大肠杆菌基因工程(1)30P乳糖启动子PlaclacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起,在没有诱导物存在时,
17、整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达;诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高lacI 负调控负调控转录受转录受 CAP 正调控和正调控和 lacI 负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)31P乳糖启动子PlaclacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起,在没有诱导物存在时,整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达;诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受转录受 CAP 正调控和正调控和 lacI 负调控负调控lacI 负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)32P乳糖启动子PlaclacOPO高效转录阻遏蛋白
展开阅读全文